Validation de méthodes de transfert de cellules souches embryonnaires humaines pour la thérapie de la cardiomyopathie associée à la dystrophie musculaire de Duchenne, Validation of methods to transfer human embryonic stem cells for the therapy of the cardiomyopathy associated with Duchenne muscular dystrophy

Thesee - Séverine Pouillot

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Sous la direction de Marc Peschanski
Thèse soutenue le 25 novembre 2008: Evry-Val d'Essonne
La cardiomyopathie associée à la DMD est une atteinte pour laquelle il n’existe pas actuellement de traitement. Les cellules souches embryonnaires humaines (hES), par leurs propriétés d’autorenouvellement et de différenciation, sont envisagées comme outil thérapeutique. Pour une recherche sur l’implantation de cellules, il n’existait pas de modèle in vitro au long cours. Nous avons ainsi développé un modèle de culture organotypique de tranches de cœur dans lequel nous avons, plusieurs mois après transplantation, retrouvé les cellules hES greffées, différenciées en cardiomyocytes. Par ailleurs, nous avons optimisé la différenciation cardiaque pour améliorer le rendement en cardiomyocytes, en induisant la différenciation cardiaque et en cultivant les cellules hES en bioréacteur. Le modèle d’étude au long terme permettant le suivi des cellules greffées dérivées de cellules hES nous permettra de valider les premières étapes précédant les études in vivo dans des modèles pathologiques.
-Culture de tranches de cœur
Cardiomyopathy associated with DMD is a frequent occurrence with no treatment. Human embryonic stem cells (hESC), because of their self-renew differentiation properties are the best candidates to cardiac cellular therapy. To investigate cells implantation, there was no long term in vitro model. Thus, we have developed an organotypic model of heart slices in which we have, several months after transplantation, found grafted hES cells with evidence of cardiac differentiation. In addition, we have optimised cardiac differentiation to improve cardiac yield, inducing cardiac differentiation and cultivating hES cells in bioreactors. During long term culture model allows the study of grafted hES cells, combines to hESC-derived cells in reasonable number and purity, will constitute validation of the first steps before in vivo studies in pathological models.
-Heart slices culture
Source: http://www.theses.fr/2008EVRY0022/document

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Publié par	Thesee
Nombre de lectures	29
Langue	English
Poids de l'ouvrage	5 Mo

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UNIVERSITE D’EVRY VAL D’ESSONNE
Ecole Doctorale Des Génomes Aux Organismes

THESE

Pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’UNIVERSITE D’EVRY VAL D’ESSONNE

Spécialité

Biologie Cellulaire et Moléculaire

Validation de méthodes de transfert de cellules souches
embryonnaires humaines pour la thérapie de la cardiomyopathie
associée à la Dystrophie Musculaire de Duchenne

Présentée par

Séverine Pouillot

Composition du jury :
M. le Professeur Francis Quétier (Président du jury)
Mme le Professeur Annelise Bennaceur-Griscelli (Rapporteur)
M. le Professeur Alain Berdeaux (Rapporteur)
M. le Docteur Otto-Wilhelm Merten (Examinateur)
Mme le Docteur Christelle Monville (Co-Directeur de thèse)
M. le Docteur Marc Peschanski (Directeur de thèse) Table des matières

Avant-propos................................................................................................................................. 3
Revue Bibliographique.................................................................................................................... 6
1. Les cellules souches embryonnaires .................................................................................. 7
1.1 Les cellules souches adultes............................................................................................. 8
1.1.1 Les différents types de cellules souches adultes ....................................................... 8
1.1.2 Les applications....................................................................................................... 11
1.1.3 Les limites ............................................................................................................... 11
Notion de plasticité........................................................................................................... 11
Problèmes pour isoler, identifier et caractériser les cellules souches adultes .................. 12
1.2 Définition et propriétés des cellules souches embryonnaires humaines (hES).............. 13
1.2.1 Historique................................................................................................................ 13
1.2.2 L’état indifférencié.................................................................................................. 15
1.2.3 La différenciation .................................................................................................... 19
1.3 Utiliser les cellules souches embryonnaires................................................................... 21
1.3.1 Sources .................................................................................................................... 22
1.3.2 Applications biomédicales ...................................................................................... 22
1.3.3 Les limites ............................................................................................................... 24
1.4 Une alternative : La reprogrammation cellulaire et les cellules souches pluripotentes
induites (iPS, induced pluripotent cells) .............................................................................. 33
2 La thérapie cellulaire de l’insuffisance cardiaque associée à la myopathie de Duchenne.... 37
2.1. L’insuffisance cardiaque associée à la DMD................................................................ 37
2.1.1. La cardiomyopathie associée à la Dystrophie Musculaire de Duchenne ............... 37
2.1.2. Modèles DMD........................................................................................................ 38
2.2. La thérapie cellulaire de l’insuffisance cardiaque......................................................... 39
2.2.1. Les modèles d’étude pour la thérapie cellulaire cardiaque .................................... 39
2.2.2 Les essais de thérapie cellulaire avec les cellules souches adultes ......................... 40
2.3. Utilisation des cellules souches embryonnaires pour la thérapie cellulaire de
l’insuffisance cardiaque 46
2.3.1 Connaissances sur le développement embryonnaire du cœur................................. 47
2.3.2 Les protocoles de différenciation guidée ................................................................ 51
2.3.3 Les limites ............................................................................................................... 54
2.4 Tissue engineering.......................................................................................................... 55
Résultats..................................................................................................................................... 58
ère1 partie: Mise au point d’un modèle organotypique battant de cœur : applications à la
thérapie cellulaire et l’étude fonctionnelle de composés pharmacologiques ........................... 59
1 Objectif de l’étude............................................................................................................. 59
2 Principaux résultats ........................................................................................................... 59
La différenciation des cellules hES en cardiomyocytes après transplantation dans les
tranches............................................................................................................................. 60
Les tranches de cœur montrent des contractions spontanées pendant plusieurs mois de
culture............................................................................................................................... 61
Les cultures organotypiques de tranche de cœur humain à l’interface air-milieu sur des
membranes semi-poreuses................................................................................................ 62
3. Interprétation des résultats ............................................................................................... 62
ème2 partie: optimisation des protocoles d’obtention des cellules cardiaques pour la thérapie 63
1. Objectif de l’étude............................................................................................................ 63
2. Principaux résultats .......................................................................................................... 63
11. Evaluation du potentiel cardiogénique des lignées SA01 et VUB01........................... 63
2. Optimisation des protocoles d’obtention des cardiomyocytes..................................... 64
2.1. Effet de l’induction des cellules hES par ajout de facteurs et/ou par co-culture sur
cellules nourricières......................................................................................................... 64
2.2. Effet de la culture en bioréacteur sur la différenciation cardiaque.......................... 65
2.3. Etablissement d’une population triée sur l’expression de KDR ............................... 65
3. Interprétation des résultats ........................................................................................... 65
Matériel et méthodes .................................................................................................................... 67
Discussion................................................................................................................................... 74
Un modèle de culture organotypique ....................................................................................... 75
Un modèle histologiquement et fonctionnellement préservé........................................... 75
Un modèle d’étude de la transplantation de cellules hES ................................................ 78
La culture en bioréacteur.......................................................................................................... 80
Conclusion-Perspectives ................................................................................................................ 83
Bibliographie 89

2

Avant-propos

3
Le sujet de ma thèse a été de valider et d’optimiser les méthodes de transfert de
cardiomyocytes, dérivés ex vivo à partir de cellules souches embryonnaires humaines, dans le
muscle cardiaque d’animaux modèles de la Dystrophie Musculaire de Duchenne.
La thérapie cellulaire ouvre des perspectives thérapeutiques nouvelles pour beaucoup
de pathologies et la preuve de concept a déjà été rapportée cliniquement dans certains cas.
Néanmoins, dans certains domaines, la source de cellules à injecter n’est pas encore
accessible, notamment dans le domaine de la cardiologie.
Le cœur est un des organes possédant une capacité de régénération limitée et donc
toute perte significative ou dysfonctionnement des cellul

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