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AVERTISSEMENT
Ce document est le fruit d’un long travail approuvé par le jury de
soutenance et mis à disposition de l’ensemble de la communauté
universitaire élargie.
Il est soumis à la propriété intellectuelle de l’auteur au même titre que sa
version papier. Ceci implique une obligation de citation et de
référencement lors de l’utilisation de ce document.
D’autre part, toute contrefaçon, plagiat, reproduction illicite entraîne une
poursuite pénale.
Contact SCD INPL : scdinpl@inpl-nancy.fr
LIENS
Code de la propriété intellectuelle. Articles L 122.4
Code de la propriété intellectuelle. Articles L 335.2 – L 335.10
http://www.cfcopies.com/V2/leg/leg_droi.php
http://www.culture.gouv.fr/culture/infos-pratiques/droits/protection.htm
INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE
Ecole Nationale Supérieure d’Agronomie et des Industries Alimentaires
Ecole doctorale Ressources Procédés Produits Environnement
Laboratoire des Sciences du Génie Chimique
Laboratoire de Biocatalyse et des Bioprocédés
THESE
Présentée à l’INPL par
Eric HUSSON
En vue d’obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE
Spécialité : Procédés Biotechnologiques et Alimentaires
SYNTHESE DE DERIVES FONCTIONNELS DE PETITS
PEPTIDES PAR VOIE ENZYMATIQUE
Soutenue publiquement le 6 novembre 2008 devant la commission d’examen
Président & Rapporteur
M. Didier Combes Professeur INSA, Toulouse
Rapporteur
M. Eric Dubreucq Professeur SupAgro, Montpellier
Examinateur
Mme Lucie Couturier Chef de projet R&D, Bioeurope, Anet
Directeur de thèse
M. Ivan Marc Directeur de Recherche, CNRS, Nancy
Co-directeurs de thèse
Mme Isabelle Chevalot Maître de Conférences, ENSAIA-INPL, Nancy
Mme Catherine Humeau Maître de Conférences, ENSAIA-INPL, Nancy
Invité
M. Frantz Fournier Maître de Conférences, ENSAIA-INPL, Nancy
à Pierre,
Remerciements
Les travaux présentés dans cette thèse ont été menés au laboratoire des Sciences du
Génie Chimique en collaboration avec le laboratoire de Biocatalyse et des Bioprocédés. Je
tiens donc à remercier M. Michel Sardin, directeur du LSGC de m’avoir accueilli dans son
laboratoire.
Je tiens aussi tout particulièrement à présenter toute ma reconnaissance à M. Ivan
Marc, Directeur de Recherche (CNRS, Nancy Université) Mme Isabelle Chevalot, Maître de
Conférences (ENSAIA, INPL, Nancy Université) et Mme Catherine Humeau, Maître de
Conférences (ENSAIA, INPL, Nancy Université) pour leur professionnalisme, leur
encadrement scientifique avisé et leur disponibilité durant ces trois années de thèse.
J’adresse mes sincères remerciements à M. Eric Dubreucq, Professeur (SupAgro
Montpellier), et à M. Didier Combes, Professeur (I.N.S.A., Toulouse) de m’avoir fait
l’honneur d’accepter de juger ce travail en tant que rapporteurs. Je remercie aussi Mme Lucie
Couturier, Chef de projet R&D, (Bioeurope, Anet) d’avoir accepté d’examiner ce travail.
Je remercie également Mme Danièle Barth, Professeur (ENSIC, INPL, Nancy
Université) pour son encadrement concernant la mise en œuvre des synthèses en CO 2
supercritique, ainsi que M. Régis Vanderesse, Chargé de Recherche (CNRS, Nancy
Université) pour son aide concernant les analyses RMN et leurs interprétations.
Je remercie M. Frantz Fournier, Maître de Conférences (ENSAIA, INPL, Nancy
Université) de m’avoir encadré pour la modélisation des cinétiques et de participer à mon jury
de thèse en tant qu’invité.
Merci à M. Fabrice Blanchard, Ingénieur de Recherche (CNRS), M. Xavier
Framboisier, Ingénieur d’Etudes (CNRS) et Mme Christelle Harscoat, Chargé de Recherche
(CNRS) pour leurs compétences en techniques analytiques qu’ils m’ont apportées et
enseignées sans lesquelles ce projet n’aurait pu être mené à bien.
Je remercie aussi tous les autres membres du LSGC et du LBB que je n’ai pas cités pour leur
soutien, leur aide et leurs conseils.
Finalement, je remercie également les personnes qui me sont très chères (et particulièrement
une), qui se reconnaîtront en lisant cela, sans qui, les choses n’auraient que peu de sens.
Abréviations
ATR Attenuated total reflexion
SIC Single ionic chromatogram
CCM Chromatographie sur couche mince
CLHP Chromatographie liquide haute performance
SM Spectrométrie de masse
n
SM Spectrométrie de masse par fragmentation (n : niveaux de fragmentation)
RMN Résonance magnétique nucléaire
IRTF Spectroscopie infra rouge à transformée de Fourier
LC-ESI-MS Liquid Chromatography ElectroSpray Ionisation Mass Spectrometry
DEDL Détecteur évaporatif à diffusion de lumière
CAL B Lipase B de Candida antarctica
PCL Lipase de Pseudomonas cepacia
DPPH 1-Diphényl-2-picrylhydraxyl
XO / X Xanthine Oxydase / Xanthine
Trolox Acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchroman-2-carboxylique
M B 2-Méthyl-2-butanol 2 2
+[Emim] 1-Ethyl-3-méthylimidazolium
+
[Bmim] 1-Butyl-3-méthylimidazolium
+
[Hmim] 1-Hexyl-3-méthylimidazolium
+[Omim] 1-Octyl-3-méthylimidazolium
+[Btma] Butyltriméthylammonium
+
[MOEMIM] 1-Méthoxy éthyl-3-méthylimidazolium
+
[MEBu3P] 2-Méthoxy éthyl (tri-n-butyl) phosphonium
-[N(CN) ] Dicyanimide 2
-
[EtSO ] Ethyle sulfate 4
-
[TfO] Trifluorométhane sulfonate
-[NTf ] Bis(trifluoromethanesulfonyl) imide 2
-
[BF ] Tétrafluoroborate 4
-
[PF ] Hexafluorophosphate 6
TMECOENG 512 Cocosalkyl pentaéthoxi-méthyl ammonium méthosulfate
Sommaire
Introduction………………………………………………………………………………….14
I. Etude bibliographique ................................................................................................... 17
1. Introduction – Préambule ............................................................................................. 17
2. La réaction d’acylation................................................................................................. 18
2.1. L’acylation par voie chimique.............................................................................. 18
2.2. L’acylation par voie enzymatique ........................................................................ 19
3. Les enzymes catalysant les réactions d’acylation ........................................................ 20
3.1. Généralités............................................................................................................ 21
3.2. Les lipases ............................................................................................................ 22
3.2.1. Généralités sur les lipases ............................................................................ 22
3.2.2. Réactions catalysées par les lipases.............................................................. 23
3.2.3. Propriétés de sélectivité des lipases. ............................................................ 23
3.2.4. Structure des lipases ..................................................................................... 26
3.2.5. Mécanisme d’action des lipases – exemple de la lipase B de Candida
antarctica ..................................................................................................................... 27
3.3. Autres enzymes biocatalysant la réaction d’acylation ......................................... 29
3.3.1. Les acylases.................................................................................................. 29
3.3.2. Les carboxyl-estérases.................................................................................. 31
3.3.3. Les protéases ................................................................................................ 32
3.3.4. Les acyl-transférases .................................................................................... 33
4. Les paramètres influençant l’acylation enzymatique ................................................... 35
4.1. Influence de l’eau. ................................................................................................ 36
4.2. Influence de l’éta