Synthèse de dérivés fonctionnels de petits peptides par voie enzymatique, Synthesis of functional derivative peptides by enzymatic way

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Sous la direction de Ivan Marc
Thèse soutenue le 06 novembre 2008: INPL
Ce travail a consisté à étudier la N et/ou O acylation enzymatique d’alcool aminés et de dipeptides.Une étude préliminaire consacrée à l’acylation enzymatique d’une molécule modèle, le 6-amino-1-hexanol a démontré la capacité de la lipase B de Candida antarctica immobilisée à catalyser l’acylation de ce substrat dans différents milieux réactionnels. La mise en œuvre de cette réaction en solvants organiques (hexane, 2-méthyl-2-butanol) a conduit à la formation du produit diacylé avec un rendement de 85 % montrant l’absence de chimio-sélectivité de la réaction. L’utilisation de système sans solvant à base d’acide gras libre et de CO2 supercritique a permis d’orienter la chimio-sélectivité de la réaction en faveur de la O-acylation. Les liquides ioniques à cation de type imidazolium et à anions faiblement nucléophiles ont conduit à un taux de conversion de l’alcool aminé de l’ordre de 99 % tout en conservant l’absence de chimio-sélectivité observée en solvant organique. L’étude s’est ensuite focalisée sur l’acylation de dipeptides modèles tels que la Lys-Ser,HCl et la Ser-Leu. L’étude de l’acylation catalysée par la lipase B de Candida antarctica immobilisée de la Lys-Ser,HCl a montré une sélectivité exclusive en faveur de l’acylation de la fonction amine en position e, indépendamment du milieu réactionnel. La O-acylation de la Ser-Leu a permis de mettre en évidence l’influence du groupe carboxylique Cterminal électro-attracteur de Lys-Ser sur la réactivité de la fonction hydroxyle de la sérine. Enfin, la N-acylation enzymatique d’un dipeptide naturel bioactif, la carnosine a été réalisée d’une part en solvant organique, catalysée par la lipase B de Candida antarctica immobilisée et d’autre part, en milieu aqueux biphasique catalysée par l’acyl-transférase de Candida parapsilosis. L’acylation de la carnosine, conduisant à la synthèse de N-oléyl carnosine, n’affecte pas son activité inhibitrice de la xanthine oxydase et semble améliorer son activité anti-radicalaire vis-à-vis de l’anion superoxyde
-N et/ou O-acylation
-Sélectivité
-CO2 supercritique
-Liquide ionique
-Système sans solvant
-Solvant organique
-Acyl-transférase
-Lipase CAL B
-Dipeptides
The present work consisted in studying the N and/or O-enzymatic acylation of amino alcohols and dipeptides. A preliminary study was firstly undertaken about the enzymatic acylation of a bifunctionnal model molecule, 6-amino-1-hexanol and demonstrated the ability of the lipase B of Candida antarctica to catalyze the acylation of this substrate in different reaction media. The reaction performed in organic solvents (hexane, 2-methyl-2-butanol) allowed to the synthesis of the diacylated product with a substrate conversion yield of 85 %, showing the absence of chimio-selectivity of the reaction. The use of a solvent-free system constituted of free fatty acid and the use of supercritical carbon dioxide permitted to orientate the selectivity of the reaction in favour of the O-acylation. Ionic liquids with imidazolium cation and few nucleophilic anions led to a substrate conversion of 99 % and to maintain the absence of chemo-selectivity observed in organic solvents. Then, the study focused on the acylation of model dipeptides like Lys-Ser, HCl and Ser-Leu. Results relative to the acylation of Lys-Ser, HCl catalyzed by the lipase B of Candida antarctica immobilized showed a selectivity in favour of the acylation of the e-amino function independently of the reaction medium. The Ser-Leu O-acylation permitted to demonstrate the influence of the molecular environment (electro-attractor C terminal carboxylic group) on the reactivity of the serine hydroxyl function. Finally, the enzymatic acylation of a bioactive dipeptide was catalyzed by the lipase B of Candida antarctica immobilized in organic solvent and by the acyl-transferase of Candida parapsilosis in lipid-aqueous biphasic medium. The acylation of carnosine allowed the N-oleyl carnosine synthesis. The acylation of carnosine did not affect its xanthine oxydase inhibition activity and seemed to improve its superoxyde anion scavenging property
-N and/or O-acylation
-Supercritical carbon dioxyde
-Solvent- free system
-Acyl-transferase
-Dipeptides
-Lipase CAL B
-Ionic liquid
-Selectivity
-Organic solvent
Source: http://www.theses.fr/2008INPL061N/document
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98

Langue

Français

Poids de l'ouvrage

3 Mo


AVERTISSEMENT



Ce document est le fruit d’un long travail approuvé par le jury de
soutenance et mis à disposition de l’ensemble de la communauté
universitaire élargie.
Il est soumis à la propriété intellectuelle de l’auteur au même titre que sa
version papier. Ceci implique une obligation de citation et de
référencement lors de l’utilisation de ce document.
D’autre part, toute contrefaçon, plagiat, reproduction illicite entraîne une
poursuite pénale.

Contact SCD INPL : scdinpl@inpl-nancy.fr




LIENS




Code de la propriété intellectuelle. Articles L 122.4
Code de la propriété intellectuelle. Articles L 335.2 – L 335.10
http://www.cfcopies.com/V2/leg/leg_droi.php
http://www.culture.gouv.fr/culture/infos-pratiques/droits/protection.htm
INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE
Ecole Nationale Supérieure d’Agronomie et des Industries Alimentaires
Ecole doctorale Ressources Procédés Produits Environnement

Laboratoire des Sciences du Génie Chimique
Laboratoire de Biocatalyse et des Bioprocédés

THESE

Présentée à l’INPL par

Eric HUSSON

En vue d’obtenir le grade de

DOCTEUR DE L’INSTITUT NATIONAL POLYTECHNIQUE DE LORRAINE
Spécialité : Procédés Biotechnologiques et Alimentaires


SYNTHESE DE DERIVES FONCTIONNELS DE PETITS
PEPTIDES PAR VOIE ENZYMATIQUE



Soutenue publiquement le 6 novembre 2008 devant la commission d’examen



Président & Rapporteur
M. Didier Combes Professeur INSA, Toulouse

Rapporteur
M. Eric Dubreucq Professeur SupAgro, Montpellier

Examinateur
Mme Lucie Couturier Chef de projet R&D, Bioeurope, Anet

Directeur de thèse
M. Ivan Marc Directeur de Recherche, CNRS, Nancy

Co-directeurs de thèse
Mme Isabelle Chevalot Maître de Conférences, ENSAIA-INPL, Nancy
Mme Catherine Humeau Maître de Conférences, ENSAIA-INPL, Nancy

Invité
M. Frantz Fournier Maître de Conférences, ENSAIA-INPL, Nancy























à Pierre,











Remerciements

Les travaux présentés dans cette thèse ont été menés au laboratoire des Sciences du
Génie Chimique en collaboration avec le laboratoire de Biocatalyse et des Bioprocédés. Je
tiens donc à remercier M. Michel Sardin, directeur du LSGC de m’avoir accueilli dans son
laboratoire.
Je tiens aussi tout particulièrement à présenter toute ma reconnaissance à M. Ivan
Marc, Directeur de Recherche (CNRS, Nancy Université) Mme Isabelle Chevalot, Maître de
Conférences (ENSAIA, INPL, Nancy Université) et Mme Catherine Humeau, Maître de
Conférences (ENSAIA, INPL, Nancy Université) pour leur professionnalisme, leur
encadrement scientifique avisé et leur disponibilité durant ces trois années de thèse.
J’adresse mes sincères remerciements à M. Eric Dubreucq, Professeur (SupAgro
Montpellier), et à M. Didier Combes, Professeur (I.N.S.A., Toulouse) de m’avoir fait
l’honneur d’accepter de juger ce travail en tant que rapporteurs. Je remercie aussi Mme Lucie
Couturier, Chef de projet R&D, (Bioeurope, Anet) d’avoir accepté d’examiner ce travail.
Je remercie également Mme Danièle Barth, Professeur (ENSIC, INPL, Nancy
Université) pour son encadrement concernant la mise en œuvre des synthèses en CO 2
supercritique, ainsi que M. Régis Vanderesse, Chargé de Recherche (CNRS, Nancy
Université) pour son aide concernant les analyses RMN et leurs interprétations.
Je remercie M. Frantz Fournier, Maître de Conférences (ENSAIA, INPL, Nancy
Université) de m’avoir encadré pour la modélisation des cinétiques et de participer à mon jury
de thèse en tant qu’invité.
Merci à M. Fabrice Blanchard, Ingénieur de Recherche (CNRS), M. Xavier
Framboisier, Ingénieur d’Etudes (CNRS) et Mme Christelle Harscoat, Chargé de Recherche
(CNRS) pour leurs compétences en techniques analytiques qu’ils m’ont apportées et
enseignées sans lesquelles ce projet n’aurait pu être mené à bien.
Je remercie aussi tous les autres membres du LSGC et du LBB que je n’ai pas cités pour leur
soutien, leur aide et leurs conseils.
Finalement, je remercie également les personnes qui me sont très chères (et particulièrement
une), qui se reconnaîtront en lisant cela, sans qui, les choses n’auraient que peu de sens.

Abréviations

ATR Attenuated total reflexion
SIC Single ionic chromatogram
CCM Chromatographie sur couche mince
CLHP Chromatographie liquide haute performance
SM Spectrométrie de masse
n
SM Spectrométrie de masse par fragmentation (n : niveaux de fragmentation)
RMN Résonance magnétique nucléaire
IRTF Spectroscopie infra rouge à transformée de Fourier
LC-ESI-MS Liquid Chromatography ElectroSpray Ionisation Mass Spectrometry
DEDL Détecteur évaporatif à diffusion de lumière
CAL B Lipase B de Candida antarctica
PCL Lipase de Pseudomonas cepacia
DPPH 1-Diphényl-2-picrylhydraxyl
XO / X Xanthine Oxydase / Xanthine
Trolox Acide 6-hydroxy-2,5,7,8-tétraméthylchroman-2-carboxylique
M B 2-Méthyl-2-butanol 2 2
+[Emim] 1-Ethyl-3-méthylimidazolium
+
[Bmim] 1-Butyl-3-méthylimidazolium
+
[Hmim] 1-Hexyl-3-méthylimidazolium
+[Omim] 1-Octyl-3-méthylimidazolium
+[Btma] Butyltriméthylammonium
+
[MOEMIM] 1-Méthoxy éthyl-3-méthylimidazolium
+
[MEBu3P] 2-Méthoxy éthyl (tri-n-butyl) phosphonium
-[N(CN) ] Dicyanimide 2
-
[EtSO ] Ethyle sulfate 4
-
[TfO] Trifluorométhane sulfonate
-[NTf ] Bis(trifluoromethanesulfonyl) imide 2
-
[BF ] Tétrafluoroborate 4
-
[PF ] Hexafluorophosphate 6
TMECOENG 512 Cocosalkyl pentaéthoxi-méthyl ammonium méthosulfate

Sommaire



Introduction………………………………………………………………………………….14

I. Etude bibliographique ................................................................................................... 17

1. Introduction – Préambule ............................................................................................. 17
2. La réaction d’acylation................................................................................................. 18
2.1. L’acylation par voie chimique.............................................................................. 18
2.2. L’acylation par voie enzymatique ........................................................................ 19
3. Les enzymes catalysant les réactions d’acylation ........................................................ 20
3.1. Généralités............................................................................................................ 21
3.2. Les lipases ............................................................................................................ 22
3.2.1. Généralités sur les lipases ............................................................................ 22
3.2.2. Réactions catalysées par les lipases.............................................................. 23
3.2.3. Propriétés de sélectivité des lipases. ............................................................ 23
3.2.4. Structure des lipases ..................................................................................... 26
3.2.5. Mécanisme d’action des lipases – exemple de la lipase B de Candida
antarctica ..................................................................................................................... 27
3.3. Autres enzymes biocatalysant la réaction d’acylation ......................................... 29
3.3.1. Les acylases.................................................................................................. 29
3.3.2. Les carboxyl-estérases.................................................................................. 31
3.3.3. Les protéases ................................................................................................ 32
3.3.4. Les acyl-transférases .................................................................................... 33
4. Les paramètres influençant l’acylation enzymatique ................................................... 35
4.1. Influence de l’eau. ................................................................................................ 36
4.2. Influence de l’éta

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