Collaboration entre recherche académique et industrie dans l étude d un nouveau médicament anti-

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Collaboration entre recherche académique et industrie dans l'étude d 'un nouveau médicament anti-

Ziom - Romuald Mentaverri / Alice Wattel / Anne-Sophie Lemaire-Hurtel / Said Kamel / Alexia Blesius / Michel Brazier

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Article« Collaboration entre recherche académique et industrie dans l'étude d'un nouveaumédicament anti-ostéoporotique » Romuald Mentaverri, Alice Wattel, Anne-Sophie Lemaire-Hurtel, Said Kamel, Alexia Blesiuset Michel BrazierM/S : médecine sciences, vol. 21, n° 6-7, 2005, p. 663-668. Pour citer cet article, utiliser l'adresse suivante :http://id.erudit.org/iderudit/011202arNote : les règles d'écriture des références bibliographiques peuvent varier selon les différents domaines du savoir.Ce document est protégé par la loi sur le droit d'auteur. L'utilisation des services d'Érudit (y compris la reproduction) est assujettie à sa politiqued'utilisation que vous pouvez consulter à l'URI http://www.erudit.org/apropos/utilisation.htmlÉrudit est un consortium interuniversitaire sans but lucratif composé de l'Université de Montréal, l'Université Laval et l'Université du Québec àMontréal. Il a pour mission la promotion et la valorisation de la recherche. Érudit offre des services d'édition numérique de documentsscientifiques depuis 1998.Pour communiquer avec les responsables d'Érudit : erudit@umontreal.ca Document téléchargé le 21 September 2011 12:03MEDECINE/SCIENCES 2005 ; 21 : 663-8Collaboration entre recherche Titre Hypothese académique et industrie Titre > L’activité de l’ostéoclaste, cellule en charge de la dans auteur Hypothese l’étude Debatrésorption osseuse, est soumise à différents facteurs d’un nouveau de régulation. Parmi eux, ceux issus ...

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« Collaboration entre recherche académique et industrie dans l'étude d'un nouveau médicament anti-ostéoporotique » Romuald Mentaverri, Alice Wattel, Anne-Sophie Lemaire-Hurtel, Said Kamel, Alexia Blesius et Michel Brazier M/S : médecine sciences, vol. 21, n° 6-7, 2005, p. 663-668. Pour citer cet article, utiliser l'adresse suivante : http://id.erudit.org/iderudit/011202ar Note : les règles d'écriture des références bibliographiques peuvent varier selon les différents domaines du savoir.

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scientifiques depuis 1998. Pour communiquer avec les responsables d'Érudit :erudit@umontreal.ca

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MEDECINE/SCIENCES2005 ; 21 : 663-8

>L’activité de l’ostéoclaste, cellule en charge de la résorption osseuse, est soumise à différents facteurs de régulation. Parmi eux, ceux issus de la matrice, en particulier les minéraux qui en sont libérés, comme le calcium, sont déterminants. Nous avons montré que la variation de concentration en calcium dans le milieu régulait l’activité de résorption et la durée de vie des ostéoclastes. Le développement d’une nouvelle thérapeutique, le ranélate de strontium, a montré des effets cliniques très intéressants repo-sant sur une stimulation des activités de formation de l’os par les ostéoblastes et une modulation des activités de résorption osseuse. Sur la base de nos connaissances de la physiologie de l’ostéoclaste, en particulier des voies de signalisation calcique, et de la maîtrise de différents modèles cellulaires osté-oclastiques, une collaboration logique s’est créée entre notre laboratoire et Servier afin d’approfondir les mécanismes à l’origine des effets du ranélate de strontium sur les ostéoclastes. En quelques années, cette collaboration s’est progressivement enrichie d’autres intervenants scientifiques afin de mieux éclairer ces mécanismes. Il a ainsi été montré que le strontium interagissait probablement avec le récepteur sensible au calcium et que les voies de signalisation intracellulaires activées par le calcium et le ranélate de strontiumviace récepteur étaient différentes. Dans le cadre de cette coopération avec Servier, des échanges avec d’autres laboratoires universitaires ont été initiés, telles que la mise en commun de techniques et de connaissances. Ainsi, il a été possible de confirmer la présence du récepteur sensible au calcium sur les ostéoclastes et de mon-trer son rôle dans les effets du ranélate de strontium sur l’ostéoclaste.<

Collaboration entre recherche académique et industrie dans l’étude d’un nouveau médicament anti-ostéoporotique Romuald Mentaverri, Alice Wattel, Anne-Sophie Lemaire-Hurtel, Said Kamel, Alexia Blesius, Michel Brazier

L’ostéoporose est une ostéopathie fragilisante diffuse caractérisée par une masse osseuse basse et une détériora-tion de la micro-architecture du tissu osseuxinduisant une fragilité osseuse à l’origine d’un risque de fracture[1]. En

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R. Mentaverri, A. Wattel, A.S. Lemaire-Hurtel, S. Kamel, M. Brazier : Unité de Recherche des mécanismes de la résorption osseuse, France, l’incidence annuelleFaculté de Pharmacie, 1, rue des fractures ostéoporoti-des Louvels, 80037 Amiens, ques est de 130000, et onFrance. estime aujourd’hui qu’envi-A. Blesius : Institut de ron une femme sur deux seraRecherches Internationales concernée. Parmi ces frac-Servier, Courbevoie, France. tures, on dénombre 50000 fractures du col fémoral[2], et on estime à 40 000 le nombre de fractures du poignet et à 40000 le nombre de fractures asymptomatiques des vertèbres. De plus, malgré la difficulté d’évaluer le nombre de fractures vertébrales asymptomati-ques, on estime qu’il est trois fois supérieur au nombre de fractures vertébrales symptomatiques. Actuellement dans le monde, 1 600 000 fractures de hanche par an ont des consé-quences importantes sur la mortalité et la morbidité[2]. La fragilisation osseuse est liée à de multiple facteurs,princi-palement la masse osseuse, mais aussi la masse corporelle ainsi que des facteurs génétiques et environnementaux. Il a par exemple été décrit que 80 à 85 % de la densité minérale osseuse était déterminée par des facteurs génétiques[3-5], et on estime qu’en cas d’antécédent familial de fracture ostéoporotique chez un parent du premier degré, une femme a un risque doublé d’être victime à son tour d’ostéoporose [6]. Par ailleurs, le vieillissement de la population, qui aura pour conséquence un doublement du nombre des personnes de plus de 65 ans, entraînera d’ici 2040 un doublement du nombre de fractures[7]. Pour ces différentes raisons, il était important de proposer une prise en charge appropriée de

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l’ostéoporose, un dépistage élargi, un traitement par des médica-ments freinant la perte osseuse et permettant aussi une stimulation de l’ostéogenèse. Les traitements disponibles actuellement sont sur-tout des médicaments antirésorptifs (bisphosphonates, traitement hormonal, modulateurs sélectifs des récepteurs des œstrogènes). Une nouvelle approche thérapeutique consiste à stimuler la forma-tion osseuse, en particulier chez les sujets dont la perte de masse osseuse est importante (tériparatide). Une autre voie envisagée conjugue une action antirésorptive et une action ostéoformatrice. Servier a développé un médicament présentant cette double activité [8-11]et montrant un bénéfice significatif chez les patients traités : le ranélate de strontium formé de 2atomes de strontium stable couplés à une molécule d’acide ranélique. Le ranélate de strontium permet de réduire significativement l’incidence des fractures verté-brales et de hanche[12, 13]. Il est établi que le ranélate de stron-tium agit sur l’ostéoclaste, cellule en charge de la résorption osseuse, mais les mécanismes moléculaires à l’origine de ces effets restent encore mal connus. En raison de notre expertise dans ce domaine, en particulier des modèles cellulaires que nous avons développés, une collaboration scientifique avec Servier a pu être établie afin d’éclairer les mécanismes d’action du ranélate de strontium sur la résorption osseuse et les ostéoclastes. Ainsi, nous avons été amenés à élargir notre champ d’expertise et de nouvelles collaborations scientifiques se sont mises en place par l’intermédiaire de Servier. Cet article illustre la collaboration entre un laboratoire industriel et un laboratoire de recherche académique, décrit les moyens mis à disposition pour permettre une meilleure connaissance d’un produit et l’évolution de cette collaboration pour accéder à de nouveaux moyens d’investigation.

Les modèles cellulaires ostéoclastiques

Physiologie de l’ostéoclaste Le processus de différenciation ostéoclastique permet d’obtenir à partir des précurseurs hématopoïétiques CFU-GM (colony forming unit-granulocyte macrophage) des ostéoclastes matures(Figure 1). Ce pro-cessus est complexe et débute dans la moelle osseuse où se trouvent ces précurseurs[14]. La différenciation des ostéoclastes nécessite une interaction étroite avec les cellules stromales exprimant à leur surface deux cytokines nécessaires à leur différenciation: le RANKL (receptor activator of NFkB ligand) et le M-CSF (macrophage-colony stimula-ting factor)[15]. Ces cytokines déclenchent l’activation des voies de signalisation intracellulaire et permettent d’une part, l’expression de protéines spécifiques de l’ostéoclaste, telles que le récepteur de la calcitonine et la phosphatase résistante à l’acide tartrique (TRAP) et d’autre part, la fusion des précurseurs à l’origine de la formation de cellules multinucléées, incapables de se diviser. L’ostéoprotégérine, récepteur leurre du RANKL, également produit par les cellules stro-males et les ostéoblastes, inhibe quant à elle la différenciation des ostéoclastes[16]. Au cours de sa différenciation, l’ostéoclaste migre vers la surface osseuse destinée à être résorbée. L’étape d’adhésion qui en résulte, ainsi que la formation d’un compartiment sub-ostéo-

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clastique, est très importante car nécessaire à l’activation des ostéoclastes. Elle se fait grâce à l’interaction étroite des intégrines exprimées à la surface des ostéoclastes, principalementαvβ3[17], avec certaines protéines de la matrice contenant la séquence RGD (Arg-Gly-Asp) telle que l’ostéopontine. Il semble que cette intégrine joue un rôle essentiel dans l’adhésion, la motilité et l’activation des ostéoclastes. Une fois attaché, l’ostéoclaste se polarise et une bordure en brosse, ou bordure plissée, se forme au niveau de la zone de con-tact entre ostéoclaste et matrice osseuse. L’ostéoclaste sécrète alors dans ce compartiment sub-ostéoclastique des protons induisant une déminéralisation de la matrice calcifiée et des enzymes protéolytiques (collagénases, métallo-protéases, cathepsine K) dégradant la partie organique de la matrice osseuse, composée à 90 % de collagène de type I. Au cours du phénomène de résorption, l’ostéoclaste se déplace à la surface de la matrice, créant ainsi une lacune de résorption et libérant des produits de dégradation issus de cette matrice. Après plusieurs cycles de résorption et de migration, l’ostéoclaste se détache de la matrice et entre en apoptose[18]. Le déclenchement de l’apoptose n’est pas totalement élucidé, mais il semble que certains produits de dégradation de la matrice pourraient être en partie responsables de cette mort cellulaire programmée. Parmi eux, le calcium, principal constituant minéral de la matrice osseuse, présent en grande quantité dans le compartiment sub-ostéoclastique [19], est capable d’induirein vitrol’apoptose des ostéoclastes[20]. Cet effet sur l’apoptose pourrait être lié à la présence sur l’ostéoclaste d’un récepteur sensible au calcium couplé à une protéine G. L’apoptose des ostéoclastes est une étape clé dans le contrôlein vivoetin vitrode la résorption osseuse car elle détermine la durée pendant laquelle un ostéoclaste est capable de dégrader la matrice osseuse. Différentes périodes de la vie de l’ostéoclaste se trouvent donc être déterminantes dans la régulation de la résorption osseuse. Parmi elles, les phases de différenciation, de résorption osseuse et d’apop-tose des ostéoclastes sont actuellement les trois cibles thérapeuti-ques majeures des médicaments anti-ostéoporotiques. Leur contrôle permet de réguler directement la résorption osseusein vivo. Ainsi, il a été décrit que les bisphosphonates, famille majeure de substances

Figure 1.Différenciation et fonction des ostéoclastes.

anti-résorbantes, diminuaient la formation des ostéo-clastes matures par une action anti-ostéoclastogénique et agissaient également sur les ostéoclastes matures en diminuant leur activité de résorption et leur durée de vie [21]. D’autres voies de recherche sont actuellement en cours afin de développer de nouvelles thérapies anti-ostéoporotiques ayant des mécanismes d’action com-plètement innovants comme par exemple des antagonis-tes des récepteursαvβ3, capables de réduire l’adhésion des ostéoclastes sur la matrice osseuse[22].

Diversité des modèles ostéoclastiques Au sein du laboratoire, l’étude des mécanismes d’action cellulaires de substances potentiellement antirésorbantes et de leurs cibles a été rendue possible par le dévelop-pement de plusieurs modèles cellulaires d’ostéoclastes. Certains de ces modèles proviennent de la dissection d’os longs d’animaux jeunes, principalement le rat, le poulet et le lapin. Les cellules ainsi obtenues constituent des cultures primaires d’ostéoclastes matures et fonctionnels. D’autres modèles sont obtenus par différenciation cellulaire de précurseurs hématopoïétiques retrouvés dans le foie, la rate, le sang et la moelle osseuse. La différenciation des précurseurs nécessite la présence de calcitriol et d’autres cellules, stromales ou ostéoblastiques, comme c’est le cas dans les cultures mixtes de calvariae et de moelle osseuse. Depuis l’enrichissement des connaissances sur la différen-ciation des ostéoclastes et particulièrement la découverte du rôle des facteurs RANKL et M-CSF dans ce processus, il est possible de s’affranchir des méthodes de co-cultures en utilisant les protéines recombinantes directement au contact des précurseurs ostéoclastiques. Dans le cadre des études sur le ranélate de strontium, nous avons utilisé des modèles cellulaires ostéoclastiques perfor-mants, à savoir des ostéoclastes matures de lapin et des cel-lules différenciées à partir de précurseurs hématopoïétiques.

Évaluation de l’activité de résorption osseuse et de l’apoptose des ostéoclastes à l’aide d’un modèle d’ostéoclastes primaires matures Le modèle choisi pour cette étude est le modèle d’ostéoclas-tes matures isolés à partir d’os de lapin. Les cellules obtenues sont directement cultivées sur des lamelles osseuses prépa-rées à partir d’os bovin ou d’ivoire(Figure 2A), ce qui permet de disposer d’un modèle parfaitement adapté à l’étude de substances actives sur la résorption osseuse[23-25]. Ce modèle a été validé avec des substances antirésorbantes connues, telles qu’un bisphosphonate (l’ibandronate) et l’œstradiol(Figure 3). L’évaluation de la résorption osseuse se fait de plusieurs manières : (1) avec un logiciel d’analyse ® d’images (CountScan, Biocom) mesurant la surface des lacunes de résorption présentes sur les lamelles osseuses

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(Figure 2B); (2) par différentes techniques de dosage des produits de dégradation de la matrice libérés dans les surnageants de culture au cours du processus de résorption. Le collagène osseux est constitué en majorité de collagène de type I et est stabilisé par des molécules de pontage qui sont libérées lors de la dégradation de l’os par les ostéoclastes. Pour mesurer ces produits de dégradation, nous avons utilisé une technique immunologique (kit Elisa,Nordic Bioscience Diagnostics A/S, Danemark) dosant spécifique-ment les fragments C-télopeptidiques du collagène de type I, et développé une méthode utilisant la chromatographie liquide haute performance pour quantifier les molécules de pontage du collagène de type I (pyridinolines) [23]. Le modèle d’ostéoclastes matures de lapins offre également l’avan-tage de pouvoir obtenir, après traitement enzymatique, une population hau-tement purifiée d’ostéoclastes (99%)(Figure 4), permettant notamment l’étude directe de l’activité pro-apoptotique de substances sur ces cellules. L’apoptose de l’ostéoclaste est un processus physiologique, résultant d’une cascade complexe d’événements intracellulaires. Elle se caractérisein vitropar une fragmentation de l’ADN mise en évidence par la révélation d’échelles d’ADN (migration de l’ADN sur un gel d’agarose); par ailleurs, la coloration Hœchst permet de distinguer les ostéoclastes apoptotiques des ostéoclas-tes non apoptotiques(Figure 5)[26]. En effet, l’ostéoclaste apoptotique se caractérise par une condensation et une hyperfluorescence de ses noyaux, ainsi que par la visualisation nette de leur fragmentation. L’évaluation du pourcentage d’apoptose se fait par comptage des ostéoclastes apoptoti-ques et non apoptotiques.

Évaluation de la différenciation ostéoclastique Une des limites du modèle d’ostéoclastes matures réside dans le faible nombre d’ostéoclastes obtenus après le sacrifice d’un animal. De ce fait, afin d’accéder à des techniques de biologie moléculaire néces-sitant de grandes quantités de cellules, nous avons utilisé dans nos études sur le ranélate de strontium deux modèles de différenciation permettant d’obtenir des populations cellulaires riches en ostéoclas-tes. Initialement, nous avons développé un modèle murin, à partir d’une lignée monocytaire-macrophagique RAW 264.7, puis un modèle humain, à partir d’une population cellulaire hétérogène de précurseurs monocytaires isolés du sang total de donneurs. Ces deux modèles conduisent à la formation de cellules multinucléées TRAP-positives capables de résorber[27]. Les ostéoclastes-likeobtenus à (OCL) partir de la lignée RAW 264.7, après seulement 5 jours de culture, en

Figure 2.Caractérisation en microscopie optique des ostéoclastes de lapins. A. Photographie d’un ostéoclaste après coloration TRAP (Gx400).B.Photographie de lacunes de résorption sur lamelle osseuse après coloration au bleu de tolui-dine-1% borate (Gx100).

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présence de RANKL seul, représentent une population cellulaire homogène et sont largement utilisés. Le modèle humain nécessite, quant à lui, la présence simultanée des cytokines RANKL et M-CSF pendant une durée moyenne de 14 jours et présente une variabilité inter-donneur non négligeable. Les OCL issus de ce modèle ont une capacité de résorption osseuse importante en compa-raison des OCL obtenus à partir des cellules RAW 264.7. Dans les deux types de modèles de différenciation, l’évaluation du nombre d’ostéoclastes se fait classiquement après coloration par un comptage microscopique des cellules TRAP-positives multinucléées (>3 noyaux). Ainsi, dans le cadre de la colla-boration avec Servier, nous avons pu étudier le profil d’expression génique des OCL (RT-PCR, puces à ADN), l’activation des facteurs de transcription NFκB et AP-1 hautement impliqués dans la différenciation, l’activation et la survie des ostéoclastes[28, 29]et l’activation des protéines MAPK telles que JNK, Erk et p38 (Western blot). Toutes ces méthodes nous ont permis de mieux caractéri-ser nos modèles d’étude.

Le ranélate de strontium, modulateur de la signalisation intra-ostéoclastique ?

Le tissu osseux constitue la principale réserve en calcium des organismes supérieurs. La mise à disposition du calcium, présent au niveau osseux sous la forme de cris-taux d’hydroxyapatite, est un processus actif nécessitant la déminéralisation de la matrice, étape préliminaire indispensable à sa résorption. Les ostéoclastes sont alors confrontés à des concentrations très élevées de calcium ionisé[19]. Il est aujourd’hui établi que le calcium ainsi relargué participe au contrôle négatif du processus de résorption afin d’en limiter la durée et de réduire le volume osseux résorbé. Au cours des vingt dernières années, l’utilisation de modèles cellulaires tels que ceux précé-demment décrits a permis de démontrer que l’exposition des ostéoclastes à de fortes concentrations en calcium: (1) induisait une augmentation rapide de la concentra-tion en calcium intra-ostéoclastique[30]; (2) inhibait la sécrétion des protons et des enzymes protéolytiques impliqués dans la résorption osseuse[31]; et (3) stimu-lait l’apoptose des ostéoclastes matures[20]. Nos données suggèrent fortement que parmi les voies de signalisation calcique intra-ostéoclastiques(Figure 6), deux voies participent au contrôle de l’apoptose des osté-120 oclastes matures: l’une 100 liée à l’entrée capacitive de calcium par le canal 80 du récepteur du gluta-60 mate de type N-méthyl-D-aspartate, et une autre 40 liée à l’activation de la 20 voie de signalisation ino-sitol-triphosphate (IP3)-0 dépendante[26, 32]. Des Ct ŒstradiolIbandronate concentrations élevées en Figure 3.Effets de l’œstradiol (10-8M) et de l’ibandro-calcium dans le proche – 6 nate (10M) sur la résorption osseuse ostéoclastiqueenvironnement ostéo-dans un modèle d’ostéoclastes matures de lapins après 48clastique agiraient quant heures de culture.La résorption osseuse a été évaluée parà elles directement sur la mesure des surfaces de résorption à l’aide d’un logiciell’apoptose des ostéoclas-d’analyse d’images (n = 5). *p < 0,05 et **p < 0,01.tes matures. Le calcium,

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messager primaire, se fixerait ainsi au niveau d’un récepteur couplé à une protéine G, le récepteur sensible au calcium (CaSR). Le strontium présente un fort tropisme osseux; ainsi, chez les patients traités par du ranélate de strontium, les ions strontium de la matrice osseuse libérés au cours de la résorption pourraient se concentrer dans l’envi-ronnement ostéoclastique et agir sur l’ostéoclaste. Nous avons confirméin vitro, les effets inhibiteurs du rané-late de strontium sur la résorption osseuse, puis il nous a semblé judicieux d’évaluer ses effets sur l’apoptose des ostéoclastes. Nous avons montré pour la première fois que le ranélate de strontium stimulait, de façon dose-dépendante, l’apoptose des ostéoclastes matures. Parallèlement, grâce à l’utilisation conjointe de bloqueurs pharmacologiques tels que les inhibiteurs de la phospho-lipase C, de la voie de signalisation IP3-dépendante et de l’entrée capacitive de calcium (consécutive à la vidange des réserves intracellulaires de calcium), nous avons démontré l’importance de la voie de signalisation IP3-dépendante dans l’apoptose induite par le calcium. En effet, le calcium, en se liant au CaSR, stimule le clivage du phosphatidyl inositol diphosphate en IP3 et en diacyl-gly-cérol sous l’action de la phospholipase C(Figure 6). L’IP3 ainsi produit se lierait aux récepteurs de l’IP3 du réticulum endoplasmique et stimulerait la vidange des réserves calciques intracellulaires responsables des effets induits par le calcium. De façon similaire, l’apoptose induite par le ranélate de strontium serait associée à la stimulation d’un récepteur couplé à une protéine G et à l’activation d’une phospholipase C. Cependant, les effets de ces deux ions sur les ostéoclastes matures impliqueraient des voies de signalisation intracellulaire différentes et cumulatives [33]. Simultanément, Servier travaillait avec l’équipe du Docteur Edward Meigs Brown (Harvard Medical School, Boston, États-Unis) sur le rôle du CaSR dans les effets induits par le ranélate de strontium. Ainsi, parallèlement à

Figure 4.Photographie en microscopie optique (Gx400) d’une popu-lation purifiée d’ostéoclastes, apoptotiques et non apoptotiques, obtenue après culture sur plastique et coloration de Hœchst.

nos travaux, l’équipe du Dr Brown a démontré que le CaSRconfirmé, avec deux méthodes d’immunohistochimie, que les ostéoclastes serait impliqué dans l’activité ostéo-formatrice observéeexprimaient de façon constitutive le CaSR. L’adaptation des méthodes de in vitro surdes cultures d’ostéoblastes en présence detransfection cellulaire par voie rétrovirale et des méthodes d’immunohisto-ranélate de strontium. Compte tenu de ces différentschimie mises au point par l’équipe du Dr Brown à nos modèles d’ostéoclastes résultats et à l’initiative de Servier, nous avons poursuivimatures ou différenciés, a permis de mettre en évidence le rôledu CaSR nos investigations sur les voies de signalisation intracel-dans les effets du ranélate de strontium sur l’ostéoclaste. En effet, l’action lulaires impliquées dans les effets induits par le ranélatedu ranélate de strontium sur les ostéoclastes est abolie lorsque le CaSR est de strontium et le calcium sur les ostéoclastes en focali-inactivé après transfection des ostéoclastes par la forme dominant négatif sant notre attention sur le CaSR.du CaSR[34]. Les données recueillies grâce à cette mise en commun de compétences scientifiques et techniques ouvrent aujourd’hui de nouvelles Implication du récepteur sensible au calciumvoies de recherche sur le contrôle des activités de l’ostéoclaste et de la dans les effets ostéoclastiques du ranélate derésorption osseuse. strontium Conclusions L’expression du CaSR sur l’ostéoclaste est actuellement controversée. Cependant, la mise en commun des expertisesServier a rassemblé de nombreuses données cliniques et pharmacologiques respectives des différents laboratoires dans le cadre d’unapportant des preuves convaincantes sur les propriétés anti-ostéoporoti-travail post-doctoral a rapidement confirmé l’implication du CaSR dans les effets induits par le ranélate de strontium et le calcium sur l’ostéoclaste. En effet, simultanément à l’étude des voies de signalisation intracellulaires impliquées dans les effets induits par le ranélate de strontium, nous avons

Figure 5.Photographies en microscopie optique d’ostéoclastes TRAP-positifs obtenus. A.À partir des cellules RAW 264.7 cul-tivées sur plastique pendant 5 jours en présence de RANKL (30 ng/ml).B. Àpartir de cellules PBMC (peripheral blood mono-cytic cell) cultivées pendant 14 jours sur lamelle osseuse en présence de RANKL (25 ng/ml) et M-CSF (30 ng/ml)

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Figure 6.Voies impliquées dans la régulation de l’homéostasie calcique intra-ostéoclastique. L’homéostasiecalcique intra-ostéoclastique est un processus complexe qui fait intervenir de nombreux acteurs. Ces acteurs sont capables, après stimulation, d’induire une réponse biologique calcium-dépendante et de permettre à la cellule de revenir à un état de repos présentant une concentra-tion en calcium intra-ostéoclastique similaire à celle précédant la stimulation cellulaire. Deux familles de récepteurs sont capables d’induire de telles répon-ses au niveau ostéoclastique. Il s’agit de certains récepteurs de la famille des récepteurs couplés à une protéine G présentant sept domaines transmembra-naires (récepteur sensible au calcium, récepteurs métabotropiques purinergi-ques et glutamatergiques) et de différents canaux calciques transmembranai-res :canaux dont l’activité est stimulée par la vidange des réserves en calcium intracellulaire (SOC), par la fixation d’un ligand (ROC) ou par une dépolarisation membranaire (VOC). PLC: phospholipase C. PiP2: phosphatidyl inositol 4,5-diphosphate. Ins(1,4,5)P3: inositol 1,4,5-triphosphate. DAG: diacyl-glycérol. IP3R : récepteur de Ins(1,4,5)P3. RyR : récepteur de la ryanodine. CICR : vidange calcique induite par le calcium. CaM: calmoduline. PMCA: calcium-ATPase membranaire. SERCA : calcium-ATPase sarco-réticulo-endoplasmique.

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ques du ranélate de strontium. À la différence d’autres composés pharmaceutiques anti-ostéoporotiques actuellement utilisés, le rané-late de strontium présente une activité originale : il stimule l’activité ostéo-formatrice des ostéoblastes et limite l’activité ostéo-destruc-trice des ostéoclastes. Cependant, les mécanismes responsables de ces effets au niveau cellulaire restaient mal connus. Les activités de recherche de notre groupe, axées sur l’étude du rôle des processus de contrôle de l’homéostasie calcique intra-ostéoclastique dans la régu-lation de la résorption osseuse et de l’apoptose des ostéoclastes, ont permis d’explorer les effets pharmacologiques du ranélate de stron-tium. Une collaboration s’est engagée avec Servier afin de définir les voies de signalisation impliquées dans les effets anti-ostéoclastiques du ranélate de strontium. Grâce à sa connaissance approfondie de la molécule, Servier à permis de donner un cadre structuré à ces travaux de recherche appliquée tout en permettant une démarche personnelle et fondamentale. Cette collaboration s’est montrée fructueuse car elle a permis d’y associer des étudiants en formation doctorale et, en outre, a fait l’objet d’une exploitation directe des résultats obtenus, notamment en terme de communication auprès des spécialistes. En conclusion, ce sont les capacités d’adaptation et de compréhension des objectifs réciproques des partenaires qui déterminent la réussite d’une telle collaboration.‡

SUMMARY Partnership between academic research and industry to study a new anti-osteoporotic drug The activity of the osteoclast, the cell responsible for bone resorption, is subjected to different regulation factors. Amongst these, those issued from the matrix, particularly released minerals such as calcium, are determinants. We have shown that variations in calcium concentration in the medium regulates resorption activity and duration of the osteo-clast lifespan. The development of a new therapeutic agent, strontium ranelate, has shown very interesting clinical effects reliant on the stimulation of bone formation activity by osteoblasts and modulation of bone resorption activity. From our knowledge regarding osteoclast physiology, in particular calcium signaling pathways, and the control of different osteoclast cellular models, a consequent collaboration was formed between our laboratory and Servier in order to elaborate on the effects of strontium ranelate on the osteoclast. In several years, this collaboration has been further enriched by other collaborators in order to better understand this mechanism. It has also been shown that strontium likely interacts with the calcium-sensing receptor and that the pathways of intracellular signaling pathways activated by calcium and strontium ranelate via this receptor are different. In fact, within the scope of this collaboration with Servier, exchanges with other academic laboratories were initiated and collaboration on numerous techniques became possible. Then, it has been possible to confirm the presence of the calcium-sensing receptor on the osteoclasts and to demonstrate its role in the molecular events associated with strontium ranelate’s effects on the osteoclast. TIRÉS À PART A. Blesius

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M/Sn° 6-7, vol. 21, juin-juillet 2005

RÉFÉRENCES 1. Organisation Mondiale de la Santé.Guidelines for preclinical evaluation and clinical trials in osteoporosis. Geneva: WHO, 1998. 2. Baudoin C, Fardellone P, Bean K,et al.Clinical outcomes and mortality after hip fracture : a 2-year follow-up study.Bone1996 ; 18 (suppl 3): S149-57. 3. McCreadie BR, Goldstein SA. Biomechanics of fracture : Is bone mineral density sufficient to assess risk ?J Bone Miner Res: 2305-8.2000 ; 15 4. Nguyen TV, Eisman JA. Genetics of fracture : challenges and opportunities.Miner ResJ Bone2000 ; 15: 1253-6. 5. Ralston SH. The genetics of osteoporosis.Bone: 85-6.1999 ; 25 6. Harvey N, Cooper C. Determinants of fracture risk in osteoporosis.Curr Rheumatol Rep:2003 ; 5 75-81. 7. Jordan KM, Cooper C. Epidemiology of osteoporosis.Best Pract Res Clin Rheumatol2002 ; 16: 795-806. 8. Baron R, Tsouderos Y.In vitroeffects of S12911-2 on osteoclast function and bone marrow macrophage differentiation.Eur J Pharmacol: 11-7.2002 ; 450 9. Takahashi N, Sasaki T, Tsouderos Y, Suda T. S12911-2 inhibits osteoclastic bone resorptionin vitro.J Bone Miner Res: 1082-7.2003 ; 18 10. Canalis E, Hott M, Deloffre P,et al.The divalent strontium salt S12911 enhances bone cell replication and bone formationin vitro.Bone1996 ; 18: 517-23. 11. Chattopadhyay N, Yano S, Tfelt-Hansen J,et al.Strontium ranelate promotes chemotaxis, stimulates proliferation and induces genes involved in the differentiation of rat primary osteoblasts.Bone: S400.2005 ; 36 12. Meunier PJ, Roux C, Seeman E,et al.The effects of strontium ranelate on the risk of vertebral fracture in women with postmenopausal osteoporosis.N Engl J Med: 459-68.2004 ; 350 13. Reginster JY, Seeman E, De Vernejoul MC,et al.Strontium ranelate reduces the risk of nonvertebral fractures in postmenopausal women with osteoporosis : treatment of peripheral osteoporosis (TROPOS) study.J Clin Endocrinol Metab2005 ; 90: 2916-822. 14. Suda T, Takahashi N, Udagawa N,et al.Modulation of osteoclast differentiation and function by the new members of the tumor necrosis factor receptor and ligand families.Endocrinol Rev1999 ; 20: 345-57. 15. Teitelbaum SL. Bone resorption by osteoclasts.Science2000 ; 289: 1504-8. 16. Simonet WS, Lacey DL, Dunstan CR,et al.Osteoprotegerin : a novel secreted protein involved in the regulation of bone density.Cell: 309-19.1997 ; 89 17. Vaananen HK, Horton M. The osteoclast clear zone is a specialized cell-extracellular matrix adhesion structure.J Cell Sci1995 ; 108: 2729-32. 18. Manolagas SC. Birth and death of bone cells : basic regulatory mechanisms and implications for the pathogenesis and treatment of osteoporosis.Endocrinol Rev: 115-37.2000 ; 21 19. Silver IA, Murrills RJ, Etherington DJ. Microelectrode studies on the acid microenvironment beneath adherent macrophages and osteoclasts.Exp Cell Res1988 ; 175: 266-76. 20. Lorget F, Kamel S, Mentaverri R,et al.High extracellular calcium concentrations directly stimulate osteoclast apoptosis.Biochem Biophys Res Commun: 899-903.2000 ; 268 21. Zaïdi M, Blair HC, Moonga BS,et al.Osteoclastogenesis, bone resorption, and osteoclast-based therapeutics.J Bone Miner Res:599-609.2003 ; 18 22. Murphy MG, Cerchio K, Stoch SA,et al.Effect of L-000845704, an alphaVbeta3 integrin antagonist, on markers of bone turnover and bone mineral density in postmenopausal osteoporotic women.J Clin Endocrinol Metab: 2022-8.2005 ; 90 23. Lorget F, Mentaverri R, Meddah B,et al.Evaluation ofin vitrobone resorption : high-performance liquid chromatography measurement of the pyridinolines released in osteoclast cultures.Anal Biochem: 375-81.2000 ; 284 24. Kameda T, Mano H, Yuasa T,et al. Estrogen inhibits bone resorption by directly inducing apoptosis of the bone-resorbing osteoclasts.J Exp Med1997 ; 186: 489-95. 25. Wattel A, Kamel S, Mentaverri R,et al.Potent inhibitory effect of naturally occurring flavonoids quercetin and kaempferol onin vitroosteoclastic bone resorption.Biochem Pharmacol2003 ; 65 :35-42. 26. Mentaverri R, Kamel S, Wattel A,et al.Regulation of bone resorption and osteoclast survival by nitric oxide : possible involvement of NMDA-receptor.J Cell Biochem2003 ; 88: 1145-56. 27. Wattel A, Kamel S, Prouillet C,et al.Flavonoid quercetin decreases osteoclastic differentiation induced by RANKLviaa mechanism involving NFkappa B and AP-1.J Cell Biochem2004 ; 92 : 285-95. 28. Iotsova V, Caamano J, Loy J,et al.Osteopetrosis in mice lacking NF-kappaB1 and NF-kappaB2. Nat Med: 1285-9.1997 ; 3 29. Grigoriadis AE, Wang ZQ, Cecchini MG,et al.c-Fos : a key regulator of osteoclast-macrophage lineage determination and bone remodeling.Science1994 ; 266: 443-8. 30. Malgaroli A, Meldolesi J, Zallone AZ, et al. Control of cytosolic free calcium in rat and chicken osteoclasts. The role of extracellular calcium and calcitonin.J Biol Chem1989 ; 264:14342-7. 31. Datta HK, MacIntyre I, Zaidi M. The effect of extracellular calcium elevation on morphology and function of isolated rat osteoclasts.Biosci Rep1989 ; 9: 747-51. 32. Mentaverri R, Kamel S, Brazier M. Involvement of capacitive calcium entry and calcium store refilling in osteoclastic survival and bone resorption process.Cell Calcium2003; 34: 169-75. 33. Mentaverri R, Hurtel AS, Kamel S,et al.Strontium ranelate directly stimulates osteoclast apoptosis.Osteoporos Int2004 ; 15 (suppl 1) : P345MO. 34. Mentaverri R, Hurtel AS, Wattel A,et al.Calcium-sensing receptor mediates strontium ranelate-induced osteoclasts apoptosis.Bone2005 ; 36 : S403.