THÈSE Présentée l'UFR des Sciences de la Vie et de la Terre de l'Université Louis Pasteur Strasbourg pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L'UNIVERSITÉ STRASBOURG I UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR Discipline Aspects moléculaires et cellulaires de la Biologie Option Biologie Structurale par Yves NOMINÉ Caractérisation biophysique de la qualité des protéines de fusion application l'étude structurale et fonctionnelle de l'oncoprotéine virale E6 soutenue le décembre devant la Commission d'Examen Jean CAVARELLI Rapporteur Analisa PASTORE Rapporteur François PENIN Rapporteur Bernard ROQUES Examinateur Bruno KIEFFER Co directeur de thèse Gilles TRAVE Directeur de thèse

THÈSE


Présentée à l’UFR des Sciences de la Vie et de la Terre
de l’Université Louis Pasteur à Strasbourg
pour obtenir le grade de


DOCTEUR DE L’UNIVERSITÉ STRASBOURG I
UNIVERSITÉ LOUIS PASTEUR

Discipline : Aspects moléculaires et cellulaires de la Biologie
Option : Biologie Structurale

par
Yves NOMINÉ



Caractérisation biophysique de la qualité des protéines de fusion :
application à l’étude structurale et fonctionnelle de l’oncoprotéine virale E6.



soutenue le 16 décembre 2002 devant la Commission d’Examen :


Jean CAVARELLI Rapporteur
Analisa PASTORE Rapporteur
François PENIN Rapporteur
Bernard ROQUES Examinateur
Bruno KIEFFER Co-directeur de thèse
Gilles TRAVE Directeur de thèse




























A mes amis
A mon frère
A mes parents
A ma nouvelle famille …






















« Quand les grimpeurs observent de loin une montagne, tout est obstacle ; c’est en
avançant qu’ils trouvent des passages. Mais ils n’avanceraient point s’ils n’espéraient
point.] … [Essayer avec l’idée que la route est barrée, ce n’est pas essayer. Décider
d’avance que les choses feront obstacle au vouloir, ce n’est pas vouloir. Aussi voit-on
des inventeurs, explorateurs et autres réformateurs qui ne croient pas à ce barrage
imaginaire que ferait la montagne de loin. Et cette vertu d’essayer aussitôt et devant soi,
est bien l’espérance. »

Alain « Les passions et la Sagesse ». Pg 187.






Je dédie ce manuscrit et ce travail à Jean-François Lefèvre. Jean-François m’aura exprimé
immédiatement sa confiance en m'accueillant dans son laboratoire. Il m'aura soutenu et encouragé jusqu'à
la fin. Je le laisse juge de la progression de ce travail, et ose espérer qu’il ne le regrette pas.

Je voudrais exprimer toute ma gratitude à mon directeur de thèse, Gilles Travé, ainsi qu’à mon
codirecteur, Bruno Kieffer, qui ont su tous deux me faire partager leurs larges connaissances et leur passion
pour la recherche. Je suis très reconnaissant à Gilles de m’avoir intégré dès le début au projet E6. Je lui
dois aujourd’hui entre autre toutes mes connaissances des techniques de paillasse et de biochimie, et bien
plus encore. J’ai par ailleurs beaucoup apprécié qu’il me laisse libre de m’engager dans de nouvelles
directions de recherche. Je n’oublierai jamais sa gentillesse, sa patience et sa personnalité emplie
d’humanité. Bruno, pour sa part, m’a offert la possibilité de travailler dans une équipe à la pointe de la
technologie RMN, en me faisant partager sa vision de la Science « avec les mains » (sans arrière pensée
aucune). Durant toutes ces années, son investissement pour moi aura finalement porté ses fruits. Il a su
aussi donner la cohésion dont le groupe avait besoin dans les moments difficiles. Je lui suis par ailleurs
reconnaissant d'avoir cru en mes capacités d'enseignant. Merci à eux deux.

Je remercie Madame A. Pastore et Messieurs J. Cavarelli, F. Penin, B. Roques de m'avoir fait l'honneur de
juger ce travail de thèse.

Je remercie très chaleureusement Tutik Ristriani. Evidemment je pourrai dire que sans elle, ce travail
n'aurait pas acquis sa dimension biologique. Mais surtout notre collaboration ne s’est pas arrêtée là : un
grand merci pour son amitié et sa bonne humeur de tous les jours. Les critiques justifiées, l'enthousiasme et
la richesse des discussions avec Etienne Weiss m'ont aidés à persévérer dans ce sujet difficile. J’ai trouvé en
Claude Kédinger une personne toujours à l’écoute, prête à m’appuyer lorsque cela s’avérait nécessaire. Je
remercie Danièle Altschuh et Marc Van-Regenmortel de m’avoir laissé accéder au BIAcore 2000, ainsi
que Laurence Choulier pour son aide précieuse.
J’ai côtoyé pendant mon doctorat deux équipes de recherche : l’immunotechnologie et la RMN. Toutes
deux sont indissociables de ce travail de recherche. J’admire, en Claude Ling et en Georges Schwalbach, leur
patience, leur disponibilité et leurs conseils de tous les instants. Je n’oublierai jamais les discussions aussi
diverses que variées avec Emeric Wasielewski, ni la rigueur sans faille –qualité parmi tant d’autres plus
que nécessaire dans un tel sujet– de Sebastian Charbonnier. J’exprime toute ma sympathie à Andrew
Atkinson, Marie-Aude Coutouly, Annick Dejaeggere, Baudouin Dillman, Virginie Gervais, Florence
Gaudin, Esther Kellenberger, Virginie Lafont, Finton Sirokin (en RMN), ainsi que Géraldine Brandner,
Dominique Desplancq, François Déryckère, Georges Orfanoudakis, Magali Lagrange, Murielle Masson,
Philip Robinson, Annie-Paule Sibler (en Immuno) et salue la contribution de chacun dans la vie d’un
groupe.

Mon travail de thèse m'aura amené à rencontrer, à l'ESBS, bien d’autres personnes à chaque étage : je
tiens à les remercier pour ces conseils de tous les jours. La liste est bien trop longue pour être mentionnée
ici. Je ferai juste une exception envers Jean-Baptiste pour ces quelques escapades neigeuses, rares moments
d’évasion totale. C’est en effet dans les Vosges que j'ai trouvé, trouve et trouverai un terrain de détente, de
ressources et de défoulements.

Enfin, je voudrais finir en exprimant mon affection à ma famille : mes parents, mon frère, et plus
particulièrement à toi, Cathy, pour ton soutien de tous les instants et, … pour notre fils Pierrot que tu
nous as donné.




ABREVIATIONS

ADN Acide DésoxyriboNucléïque MBP « Maltose Binding Protein »
ARN Acide RiboNucléique NHS N-hydroxysuccinimide
-9ANS 8-Anilino-1-Naphtalène Sulfonate Nm Nanomètre (10 m)
BSA Albumine de Sérum de Bovin NOESY Nuclear Overhauser SpectroscopY
DC Dichroïsme Circulaire PAGE « PolyAcrylamide Gel
DLS « Dynamic Light Scattering » Electrophoresis »
DO Densité Optique PM PhotoMultiplicateur
DTT DithioTréiTol RMN Résonance Magnétique Nucléaire
EDC N-ethyl-N’-(dimethylaminopropyl) rmsd « root mean square deviation »
carbodiimide hydrochloride RPE Résonance Paramagnétique
EDTA EthylèneDiamineTetreaacetic Acid Electronique
FCR Force Centrifuge Relative rpm rotation par minute
FTIR Infra Rouge par Transformée de RU « Response Unit »
Fourier SDS Sodium Dodécyl Sulfate
GST Glutathion S-Transférase SLS « Static Light Scattering »
HSQC « Heteronuclear Simple Quantum SPR Résonance Plasmonique de Surface
Correlation » s seconde
IPTG IsoPropyl-β-D- TOCSY « Total Correlation SpectroscopY »
ThioGalactopyranoside Tris Tris-hydroxyméthylamino-méthane
IR Infra Rouge
LB « Luria Broth »



TABLEAU DES ACIDES AMINÉS

A Ala Alanine M Met Méthionine
C Cys Cystéine N Asn Asparagine
D Asp Acide Aspartique P Pro Proline
E Glu Acide Glutamique Q Gln Glutamine
F Phe Phenylalanine R Arg Arginine
G Gly Glycine S Ser Serine
H His Histidine T Thr Thréonine
I Ile Isoleucine V Val Valine
K Lys Lysine W Trp Tryptophane
L Leu Leucine Y Tyr Tyrosine

PLAN


AVANT PROPOS .........................................................................................................................1


A. INTRODUCTION .............................................................................................................. 5

CHAPITRE I : Repliements et stabilité des protéines ............................................................ 7
A.I/ Le repliement d’une protéine................................................................................................ 7

A.II/ Les différents états d’une protéine exprimée in vivo............................................................ 8
A.II.1/ L’expression de protéines recombinantes ..................................................................... 8
A.II.1.a/ Corps d’inclusion et dégradation ................................................................................................ 9
♦ La composition des corps d'inclusion .............................................................................................10
♦ La réversibilité des corps d'inc