Etude synergique du couplage du Système Lactoperoxydase avec d'autres molécules naturelles actives ayant des propriétés antifongiques pour l'amélioration de la conservation en frais des bananes
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Niveau: Supérieur, Doctorat, Bac+8ACADEMIE D'AIX-MARSEILLE Université d'Avignon et des Pays de Vaucluse THESE pour obtenir le grade de Docteur en Sciences de l'UNIVERSITE d'AVIGNON ET DES PAYS DE VAUCLUSE Discipline : Sciences Agronomiques Ecole Doctorale : Sciences des Procédés-Sciences des Aliments, Montpellier présentée et soutenue publiquement par .Woeheoudama SAGOUA Le 10 Décembre 2009 Titre : Etude synergique du couplage du Système Lactoperoxydase avec d'autres molécules naturelles actives ayant des propriétés antifongiques pour l'amélioration de la conservation en frais des bananes JURY M. El MAATAOUI Professeur à l'Université d'Avignon , Président du jury H. JIJAKLI Professeur à l'Université de Gembloux , Rapporteur E. Ait BARKA Professeur à l'Université de Reims , Rapporteur G. LOISEAU Maître de Conférences à SupAgro , Co-directeur M.N. DUCAMP Ingénieur de Recherche au CIRAD , Co-directeur A. COUDRET Professeur à l'Université d'Avignon , Directeur de Thèse M. DEGRE Directeur de Nutrigenix , Invité l?utilisation d?antimicrobiens naturels d?hydrogène-iode voie naturelle de lutte intéressante système lactoperoxydase-peroxyde sciences agronomiques coudret professeur centre international de recherche agronomique pour le développement
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ACADEMIE D’AIXMARSEILLEUniversité d’Avignon et des Pays de VaucluseTHESE pour obtenir le grade de Docteur en Sciences de l'UNIVERSITE d’AVIGNON ET DES PAYS DE VAUCLUSEDiscipline : Sciences Agronomiques Ecole Doctorale : Sciences des ProcédésSciences des Aliments, Montpellier présentée et soutenue publiquement par .Woeheoudama SAGOUALe 10 Décembre 2009 Titre :Etude synergique du couplage du Système Lactoperoxydase avec
d’autres molécules naturelles actives ayant des propriétés
antifongiques pour l’amélioration de la conservation en frais des
M. El MAATAOUI H. JIJAKLI E. Ait BARKA G. LOISEAU M.N. DUCAMP A. COUDRET M. DEGRE
bananes
JURY
Professeur à l’Université d’AvignonProfesseur à l’Université de GemblouxProfesseur à l’Université de ReimsMaître de Conférences à SupAgro Ingénieur de Recherche au CIRAD Professeur à l’Université d’AvignonDirecteur de Nutrigenix
, Président du jury , Rapporteur , Rapporteur , Codirecteur , Codirecteur , Directeur de Thèse , Invité
Remerciements
Ce travail n‟aurait pas pu se faire sans l‟aide et l‟encouragement de tous, merci donc à vous tous pour votre implication dans cette thèse. Néanmoins, je tiens à remercier particulièrement : Max REYNES, Directeur del‟UMR Qualisud, pour m‟avoir permis de réaliser mes travaux au sein de son unité. Le Pr. Alain COUDRET d‟avoir accepté d‟être mon directeur de thèse et pour ses conseils.
Merci également à Marie-Noëlle DUCAMP et Gérard LOISEAU pour avoir tout d‟abord cru en moi, pouravoir permis que cette thèse ait lieu et pour finir d‟avoir accepté de me codiriger au CIRAD. Merci à vous, Messieurs les membres du Jury, pour la confiance que vous m‟avez accordée en acceptant d‟examiner ce travail: Pr. JIJAKLI (rapporteur), Dr. Ait BARKA (rapporteur), Pr. El MAATAOUI (examinateur), M. DEGRE (invité). Je remercie l‟ensemble du personnel de la halle de technologie du CIRAD pour leur accueil et leur aide dans ces travaux de thèse et plus particulièrement Pierre PRUVOST, Marie-Christine LAHON, Jean-Michel MEOT, Olivier GIBERT, Julien RICCI, Jean-Claude DUMAS, Thierry GOLI. Je remercie également tout le personnel du bâtiment 16 du CIRAD qui d‟une manière ou une autre ont aidé à l‟avancement de mes travaux à savoir: Jean-Claude MANEZE, Renaud BOULANGER, Jean-Marc BROUILLET, Laurent BERTHIOT, Nathalie PAILLUSSON, Gilles MOREL, Marc LEBRUN, Georges PIOMBO, Nathalie BAROUH, Bruno BAREA, Clara LACHGAR, Noël DURAND, Dominique GUEULE.
Merci aussi à tous mes collègues et amis thésards et/ou docteur duCIRAD et de l‟INRA à savoir, Yohan, Privat, Emma, Emilie D., Emilie B., Marie, Christelle, Matthieu, Luis, Oscar, Aly, Mohamed, Duy, Lamiaa, Florence, Christian, Félix. Je n‟oublie pasAnne MARECHAL, Sonia BOUQUET, Ghalia RHOUL, stagiaires avec qui j‟aitravaillé et dont j‟ai aimé le grand enthousiasme.Merci aussi à toi Guy SELF pour tes nombreux conseils, pour toutes les fois où tu as révisé mon anglais pour les publications et puis aussi pour les statistiques, thanks a lot !!!! Merci aussi à Fabienne Ribeyre pour son aide en statistique et pour avoir assisté à mes répétitions. Merci à vous Didier Montet, pour vos encouragements pour vos critiques aussi sur le manuscrit et votre grande disponibilité. Merci à toi Marie-Pierre pour la mise en page du manuscrit et puis plus personnellement de m‟avoir emmené au commissariat lorsque j‟étais harcelée.Merci à toi également Jocelyne pour ta grande gentillesse à mon égard et puis je persiste à dire : « tu es la meilleure !!! ». Merci à Isabelle METAYER pour son aide et sa grande sympathie. Une pensée pour Laetitia, merci d‟avoir été bien plus qu‟une amie, ma famille sur Montpellier, sans oublier ma petite Raphaëlle et puis le petit nouveau au club Mikaël !! Pour terminer, je veux aussi remercier mes parents, mon frère Alain SAGOUA, ma tante Christine Takassi, ma cousine Edwige Takassi pour leur soutien moral et financier durant ces trois dernières, je pense que je n‟y seraijamais arrivée sans vous, encore une fois merci du fond du coeur !!!!!!!
RESUME
L‟anthracnose constitue pour plusieurs productions végétales une maladie importante qui engendre des pertes post récoltes considérables.Colletotrichum musaele responsable de est cette maladie chez la banane dessert. L‟utilisation d‟antimicrobiens naturelscomme le système lactoperoxydase (LPS) représente une voie naturelle de lutte intéressante contre l‟anthracnose. Dans cette étude, nous avons amélioré le LPS en ajoutant de l‟iode dans le système existant ou en substituant le thiocyanate par de l‟iode. Lasubstitution du thiocyanate à l‟iode a permis d‟avoir un effet fongicide du LPS.® De plus, d‟autres substances comme la lactoferrine, le Bioxedaet l‟huile de Neem ont été étudiées pour leur effet antifongique. Les deux dernières substances ont donné une inhibition supérieure respectivement à 90% et à 40%., tandis qu‟il n‟y a eu aucun effet de la lactoferrine.
® Mot–Clés :LPS, lactoferrine, Bioxéda , anthracnose,banane,Huile de Neem, Colletotrichum musae
ABSTRACT Postharvest diseases are a major concern for several plant products, leading to considerable postharvest losses.Colletotrichum musaeis responsible for anthracnose and is also involved in crown rot, the two main postharvest diseases of bananas. The use of natural anti-microbial agents such as the lactoperoxidase system (LPS) represents an interesting alternative to the use of fungicides for the control of postharvest diseases of bananas. This study consisted on optimization of the LPS by adding iodide or substituting the thiocyanate by iodide. ® Moreover, other substances like lactoferrin, Bioxeda and Neem oil were analyzed for their antifungal effect. The last two compounds gave an inhibition higher than 90% and 40% respectively. No effect of lactoferrin was observed.
® Key–Words: LPS, lactoferrin, Bioxeda , anthracnose, banana, Neem oil,Colletotrichum musae
Liste des abréviations ANOVA : Analysis of Variance APCI : Ionisation chimique à pression atmosphérique -Br : ion bromure CFU : colonie formant unité CIRAD : centre international de recherche agronomique pour le développement Cl-: ion chlorure cm : centimetre Co : Cobalt
CPG : chromatographie phase gazeuse Cu : cuivre °C : Degré Celsius DTNB : 3-carboxy-4-nitrophenydisulfide DVV : Durée de vie verte des fruits = : égale ESI :ionisation par électronébulisation Fe : fer g : gramme GO : glucose oxudase h : heure H2O2: peroxyde d‟hydrogèneHPLC : Chromatographie en phase gazeuse à haute performance -I : ion iodure IRD : institut de recherche pour le développement KD: constante d‟affinitékDa : kilodalton Kg : kilogramme Ki : iodure de potassium L : litre LF : lactoferrine LP : lactoperoxydase LPI : système lactoperoxydase-peroxyde d‟hydrogène-iode
LPS : système lactoperoxydase-peroxyde d‟hydrogène-thiocyanate LPSI : système lactoperoxydase-peroxyded‟hydrogène-thiocyanate-iode LYS: lysozyme MeOH : méthanol mg : milligramme min : minute mL : millilitre mM : millimolaire mm² : millimètre carré mV : millivolt NaBH4 : Borohydrate de sodium Ni : nickel nm : nanometre 2n : nombre de chromosomes ø : diamètre -OBr : ion hypo -OI : ion hypoiodide -OSCN : ion hypothiocyanate PDA : Potato Dextrose Agar PDB : Potato Dextrose Broth pH : potential hydrogène pK : potentiel de dissociation % : pourcentage sec : seconde SPME : Micro Extraction en Phase Solide UV : rayonnement ultra-violet µ L : microlitre µ M : micromolaire v/v : volume par volume w/v : poids par volume Zn : Zinc
Figures
Figure 1 :Diagramme de classification des cultivars à fruits parthénocarpiques Figure 2 :Schéma d‟organisation du bananier (d‟après Champion, 1963) Figure 3 :Les différentes phases de découpe et de conditionnement des fruits à la station d‟emballage(Chillet, 2003). Figure 4 : Echelle colorimétrique standard pour les bananes dessert du sous-groupe Cavendish en fonction du stade de maturation (Source : Fruidor) Figure 5 :et conidies de Acervules Colletotrichum musae (source : de Lapeyre, 1999). Figure 6 :Cycle infectieux de l‟anthracnose du bananierFigure 7 :Germination et formation d‟un appressorium à partir d‟une conidie de Colletotrichum musaeFigure 8: Différentes altérations associées àColletotrichum musaeFigure 9 :Azadirachta indica(Neem)Figure 10 :Melia azedarach: vue globale de l'arbre (a), fruits (b), feuilles (c) (source : W.SAGOUA)Figure 11 :schématique tridimensionnelle de la molécule de Structure lactoperoxydase bovine.Figure 12: Oxydation du glucose catalysée par la glucose oxydaseFigure 13 :Oxydation des groupes sulphydryles des protéines (enzymes) catalysée par la lactoperoxydaseFigure 14 :Structure tridimensionnelle de la lactoferrine bovine (en présence 3+ d‟ions Fe)Figure 15 :Schéma du procédé d‟obtention d‟huile par pression à froidFigure 16 :Montage de la presse mécanique: général (a) et détail de l‟extraction (b) Figure 17 :Schéma du procédé d'extraction de l'huile au SoxhletFigure 18 :Schéma d‟extraction des triterpénoïdes de l‟huile de NeemFigure 19 :Illustration d‟une boîte de Pétri avec de l‟huile de Neem posée sur une lame de microscope sur le couvercle Figure 20 :Evolution de la concentration relative (Concentration à l‟instant -T/Concentration initiale) en ions OSCN pendant 10mn des LPSFigure 21 :Effet du Système lactoperoxydase sur la biomasse deColletotrichum musae62 (a), C Colletotrichum sp. (b) etFusarium sp. (c) après 18 h et 24 h de culture dans du milieu PDB à 30°C sous agitation (140 trs/min) Figure 22 :Effet des Systèmes lactoperoxydase modifiésColletotrichum musaeC 62 (a),Colletotrichum sp.(b) etFusarium sp.(c) après 18 h et 24 h de culture dans du milieu PDB à 30°C sous agitation (140 trs/min)Figure 23 :Effet des Systèmes LPSI (a) et LPI (b) à différentes concentrations en iodure de potassium sur la biomasse deColletotrichum musaeC 62 après 18 h et 24 h de culture en milieu liquide PDB -1 à 30°C sous agitation (140 trs.min )Figure 24: Effet de la LF, LPS et LF/LPS sur la croissance deColletotrichum musae62 (a), C Colletotrichum sp. (b) etFusarium sp. (c) après 18 h et 24 h de culture dans du milieu PDB à 30°C sous agitation (140 trs/min) et mesurée par turbidimétrie
5 7 10 12 17 19 23 24 30 37 39 42 43 47 54 55 57 62 72 76 79 82 84 86
® Figure 25 :sur la croissance de différentesdes volatiles de Bioxeda Effet souches pathogènes de banane cultivées à 30°C mesurée après 2 jours (a, b et c) et 7 jours (d, e et f) de culture ® Figure 26 :incorporé dans du milieu de culture PDA sur laEffet du Bioxeda croissance deColletotrichum musaeC 62 (a),Colletotrichum sp.Co CMR 55 (b) etFusarium sp.mesurée pendant 5 jours de culture à 30°CFigure 27 :Graines de Neem et huiles extraites : (a) Cameroun (couleur verte, translucide) ; (b) Sénégal (couleur verte, trouble) et (c) Inde (couleur marron/orangée)Figure 28 :Schéma et bilan matière de l‟extraction par pression à froid d‟huile de Neem du Sénégal, du Cameroun et d‟Inde et de graines de Mélia.Figure 29 :Profils chromatographiques des composés volatils obtenus par GC-MS d‟huiles de graines de Neem du Cameroun, du Sénégal et d‟IndeFigure 30 :Profils chromatographiques des différentes huiles de Neem obtenus à 215 nmFigure 31 :Effet des volatils d‟huile de Neem obtenues par pression mécanique à froid (Cp) par Soxhlet (SM) et une huile commerciale (Com) sur la croissance de différentes souches pathogènes de banane cultivées à 30°C mesuré après 7 jours de culture Figure 32 :Effet de l‟huile de Neem après 2, 3, 6 et 7 jours à différentes concentrations (0,5 ; 1 ; 2%) dans du PDA sur la croissance deColletotrichum sp., cultivé à 30°C Figure 33 :Effet d‟une concentration de 2% (v/v) d‟huile de Neem dans du milieu PDA sur la croissance après 1, 2, 3, 4 et 5 jours de culture de différentes souches fongiques pathogènes de la banane cultivées à 30°C après 1, 2, 3, 4 et 5 jours. Figure 34 :Effet de différentes huiles de Neem à la concentration de 2 % (v/v) dans du milieu PDA sur la croissance deColletotrichum musae(a),Colletotrichum sp.(b) etFusarium sp.(c), cultivées à 30°C pendant 5 jours de croissance Figure 35 : Surfaces de nécrose (mm²) de bananes obtenues après de 10 jours de conservation à 20°C et 90% d‟humidité après un traitement au TBZ, LPS, LPSI, LPI, LPS+Neem (Sénégal, Cameroun, Inde), huile de Neem (Sénégal, Cameroun, Inde) et Bioxeda.
88 90 92 94 106 109 112 115 116 118 121
TABLEAUX
Tableau I :Principaux cultivars à fruits comestibles (Lassoudière, 2007). Tableau II :Liste non exhaustive des espèces du genre Colletotrichum et des plantes qu‟ils infectent (adaptée de Skippet al., 1995). Tableau III :bibliographiques sur certaines caractéristiques Données culturales et pathogéniques de différentsColletotrichum sp isolés de bananier (de Lapeyre, 1999) Tableau IV :Evolution du pouvoir pathogène d‟isolats deColletotrichum sp/banane sur différents hôtes (de Lapeyre, 1999) Tableau V :Evaluation du pouvoir pathogène deColletotrichum sp, isolés à partir de différents fruits, sur banane (de Lapeyre, 1999) Tableau VI : Données bibliographiques sur les différentes espèces fongiques isolées à partir des pourritures de couronnes, dans différentes zones de production Tableau VII :Composés bioactifs provenant du Neem (Biswaset al., 2002)Tableau VIII :Composition physico-chimique des feuilles de NeemTableau IX :Composition centésimale en acides gras de l‟huile de NeemTableau X :Caractéristiques physico-chimiques de l‟huile de NeemTableau XI :Caractéristiques physico-chimiques de la lactoperoxydase BovineTableau XII :Quelques applications du LPS et leur fonctionnalité Tableau XIII :Souches fongiques utilisées au cours de l‟étudeTableau XIV :Kit LPS fourni par BIOSERAE Tableau XV :Composition des différents Systèmes Lactoperoxydase testésTableau XVI :Comparaison entre les différentes méthodes de dosage des ions hypothiocyanate Tableau XVII :Différents traitements étudiés pour l‟anthracnose de blessureTableau XVIII :Conditions opératoiresTableau XIX :Tableau récapitulatif des caractéristiques (concentrations des réactifs et conditions d‟utilisation) de différents Systèmes lactoperoxydase utilisées dans la littératureTableau XX :Caractéristiques des différents LPS modifiés utilisés contre les trois souchesTableau XXI :Quantité d‟huile extraite dans les graines de Neem et de Mélia par première pression mécanique à froid Tableau XXII :Calcul des pertes en huile dans les tourteaux, issus de la pression à froid Tableau XXIII :Calcul des pertes en huile liées à la filtration de l‟huile obtenue par pression à froidTableau XXIV :Quantité d‟huile des graines de Neem et de Méliaobtenu par extraction au SoxhletTableau XXV :Composition en acides gras des huiles de Neem du Sénégal, du Cameroun et d‟IndeTableau XXVI :Comparaison de la composition en acides gras d‟huiles de Neem du Sénégal, du Cameroun de notre étude et du Bénin Tableau XXVII :Variabilité de la composition en acides gras des huiles
6 14 16 18 18 26 34 35 36 36 39 44 53 64 64 67 73 76 77 81 95 95 95 95 97 97
d‟Inde citées dans la littératureTableau XXVIII : Compositionen composés volatils de l‟huile de Neem (Azadirachta indica) extraite au Soxhlet (1), par pression mécanique à froid (2) d‟huile commerciale (3) et de l‟huile de Mélia (Melia azedarach) extraite au Soxhlet (4) et par pression mécanique à froid (5).Tableau XXIX :Composition en volatils de l‟huile de Neem (Azadirachta indica) de trois origines géographiques différentes (Inde, Sénégal et Cameroun).Tableau XXX :Pourcentage d‟inhibition obtenu sur des souches pathogènes exposées aux vapeurs d‟huile Neem
97 98 103 111
