Étude de l’effet de la cytokine TNFa sur la régulation de l’expression de la ?-glutamyl-transférase humaine, Effect of TNF on the regulation of -glutamyltransferase in human leukemia

Sous la direction de Marc Diederich
Thèse soutenue le 13 novembre 2008: Nancy 1
La??-glutamyltransférase (GGT) est une enzyme membranaire qui catalyse l’hydrolyse du glutathion, le principal antioxydant cellulaire. Cette enzyme est surexprimée dans de nombreux cancers (p.ex. leucémies) et appartient à une famille multigénique d’au moins treize gènes. Le gène I, qui code pour la protéine active, est exprimé en trois ARNm (A, B et C), montrant tous la même phase de lecture ouverte mais différant dans leur région 5’ non traduite. A côté de l’implication de la GGT dans le développement des cancers, elle intervient également dans l’acquisition des résistances aux traitements anticancéreux et dans la synthèse des leukotriènes. Au cours de cette thèse, nous nous sommes intéressés aux mécanismes transcriptionnels qui régulent l’expression du gène I de la GGT. Plus particulièrement, nous avons étudié la régulation de la GGT après traitement des cellules K562 avec l’ester de phorbol, TPA, et la cytokine pro-inflammatoire, TNF?? Ces deux substances activent les facteurs de transcription AP-1 et NF-?B, qui sont connus pour réguler des gènes impliqués dans le développement des chimiorésistances. Nos résultats montrent que les deux promoteurs B et C de la GGT ainsi que les trois ARNm A, B et C, la protéine GGT ainsi que l’activité enzymatique de la GGT sont induits par le TNF?, mais pas par le TPA, dans la lignée cellulaire K562, qui est établie à partir de cellules issues d’une leucémie myéloïde chronique. Vu que l’induction du promoteur C de la GGT par le TNF? est fortement diminuée avec la curcumine, un agent chimiopréventif utilisé comme inhibiteur de la voie de signalisation NF-?B, nous avons émis une première hypothèse selon laquelle le facteur de transcription NF-?B serait impliqué dans la régulation du promoteur C de la GGT dans les cellules K562. Afin de prouver notre hypothèse nous avons utilisé des siRNA ciblant spécifiquement les deux sous-unités les plus représentées de NF-?B, p50 et p65, et effectivement l’induction du promoteur C de la GGT par le TNF? est inhibée par ces siRNA. Des expériences par co-transfection avec des protéines de la voie NF-?B, TRAF2, TRADD, I?B? et p65, confirment davantage cette hypothèse selon laquelle le promoteur C de la GGT est régulé par la voie de signalisation NF-?B dans les cellules K562. Des expériences par mutation ont ensuite permis d’identifier le site sur l’ADN qui est responsable de l’induction du promoteur C de la GGT par le TNF? dans les cellules K562. Ce site, localisé de -111 à -123 par rapport au site d’initiation de la transcription, est au moins capable de fixer le facteur de transcription p50 NF-?B. A proximité de ce site, nous avons identifié un autre site fonctionnel, localisé de - 73 à – 92 par rapport au site d’initiation de la transcription, qui lie le facteur de transcription Sp1. Des analyses par chromatine immunoprécipitation (ou ChIP) ont confirmé la liaison des facteurs de transcription NF-?B et Sp1 sur le promoteur C de la GGT et montrent de plus que l’ARN polymérase II est également recruté à cet endroit précis du promoteur. En outre, ces analyses montrent que le traitement au TNF? induit la liaison des facteurs de transcription p50 NF-?B et Sp1, comparé par rapport aux cellules non traitées, sur le promoteur, et augmente considérablement le recrutement de l’ARN polymérase II à cet endroit précis du promoteur C de la GGT, expliquant ainsi l’induction observée du promoteur C de la GGT après traitement au TNF?. En conclusion, l’induction de la GGT par le TNF? peut avoir plusieurs significations biologiques importantes, à savoir augmenter la résistance aux médicaments anticancéreux, se défendre contre un stress oxydant, ou induire la synthèse des leukotriènes et donc médier l'inflammation.
-Cytokines
?-glutamyltransferase (GGT) is an enzyme that catalyzes the hydrolysis of glutathione, the major cellular antioxidant. This enzyme is overexpressed in many cancers (for example in leukemia) and belongs to a multigene family of at least thirteen genes. The GGT gene I, which encodes the active protein, is transcribed into three mRNAs (A, B and C), all showing the same open reading frame but diffeiring in their 5' untranslated region. Besides the involvement of GGT in the development of cancers, it is also involved in the acquisition of resistance to anticancer treatments and in the synthesis of leukotrienes. During this thesis, we were interested in the transcriptional mechanisms that regulate GGT gene I expression. Specifically, we studied the regulation of GGT after treatment of K562 cells with the tumor promoter TPA, and the pro-inflammatory cytokine, TNFa. Both substances activate the transcription factors AP-1 and NF-?B, which are known to regulate genes involved in the development of chemoresistance. Our results show that the two GGT promoters B and C and the three mRNA A, B and C, as well as GGT protein and GGT enzymatic activity are induced by TNFa, but not by TPA in K562 cells, which are originated from a chronic myeloid leukemia. Since the induction of the GGT promoter C by TNFa is reduced with curcumin, a natural chemopreventif agent used as an inhibitor of the NF-?B signaling pathway, we supposed that the transcription factor NF-?B is involved in the regulation of the GGT promoter C in K562 cells. To prove our hypothesis, we used siRNA targeting specifically the two main subunits of NF-?B, p50 and p65, and indeed the induction of the GGT promoter C by TNFa is inhibited by these siRNA. Co-transfection assays with proteins of the NF-?B signaling pathway, TRAF2, TRADD, I?Ba and p65, further confirm our hypothesis that the GGT promoter C is regulated via the NF-?B signaling pathway in K562 cells . Mutation experiments then identified the site on the DNA that is responsible for the induction of the GGT promoter C by TNFa in K562 cells. This site, located at -123 to -111 base pairs compared to the transcriptional start site, is able to bind at least the transcription factor p50 NF-?B. Near this site, we have identified another functional site, localized at - 73 - 92 base pairs compared to the transcriptional start site, which binds the transcription factor Sp1. Analysis by chromatin immunoprecipitation (or ChIP) confirmed the binding of the transcription factors NF-?B and Sp1 on the GGT promoter C and show that RNA polymerase II is also recruited at this specific location of the GGT promoter C. In addition, the analysis showed that treatment with TNFa induced binding of the transcription factors p50 NF-?B and Sp1, compared to untreated cells, and strongly increases the recruitment of RNA polymerase II to this location of the GGT promoter C, thus explaining the observed induction of the GGT promoter C after treatment with TNFa. In conclusion, the induction of GGT by TNFa may have several important biological significance, namely to increase resistance to anticancer drugs, to defend against oxidative stress or to induce leukotriene synthesis and thus to mediate inflammation.
Source: http://www.theses.fr/2008NAN10054/document