Développement et application de méthodes bioinformatiques pour la recherche de gènes de sRNA à boîtes H/ACA dans les génomes d’archaea et étude fonctionnelle des ARN et sRNP H/ACA correspondants, Development and application of computational methods dedicated to the identification of H/ACA box sRNAs within archaeal genomes and functional study of the corresponding RNAs and H/ACA sRNPs

Sous la direction de Christiane Branlant
Thèse soutenue le 27 novembre 2007: Nancy 1
La conversion des résidus U en pseudouridine (Y) est la modification la plus fréquente dans les ARN. Cette réaction est catalysée par des ARN:Y-synthases qui fonctionnent soit seules, soit au sein de particules snoRNP H/ACA composées de 4 protéines et d’un snoRNA. Celui-ci assure la reconnaissance de l’ARN cible par appariement de bases. Les pseudouridylations des ARNr eucaryotes sont catalysées par des snoRNP alors que les modifications des ARNt sont catalysées par des enzymes dépourvues de guide. Aucun snoRNA H/ACA n’est décrit chez les Bactéries. Trois équivalents des snoRNA H/ACA (sRNA H/ACA) avaient été découverts chez les Archaea lorsque j’ai débuté ma thèse, mais leur contribution aux modifications des ARNr n’avait pas été démontrée. Nous avons développé une approche bioinformatique permettant l’identification exhaustive de gènes de sRNA H/ACA et de leurs cibles. Nous avons ainsi identifié 7 sRNA H/ACA chez Pyrococcus abyssi et détecté 14 Y dans les ARNr. Nous avons réussi la reconstitution de particules H/ACA actives in vitro, ce qui nous a permis d’étudier leur mode d’assemblage et d’assigner 12 des Y détectées aux 7 sRNA. L’application à d’autres espèces d’archaea de l’approche bioinformatique développée nous a permis d’identifier environ 90 sRNA, nous avons ainsi pu étudier leur évolution. De plus, nous avons expérimentalement démontré pour la première fois qu’un sRNA H/ACA est impliqué dans la modification d’un ARNt. Enfin, nous avons montré que l’enzyme aCBF5 des sRNP H/ACA peut catalyser la pseudouridylation en position 55 des ARNt sans utilisation de sRNA et nous avons identifié des résidus de aCBF5 impliqués dans les activités guidée et/ou non guidée.
-Pyrococcus abyssi
The conversion of U into Pseudouridine (Y) residue is the most prevalent RNA modification. This reaction is catalysed either by stand-alone RNA:Y-synthases or by H/ACA snoRNPs composed of 4 proteins and a snoRNA. In snoRNPs the recognition of the U residue is carried out by base-pair interactions between the snoRNA and the RNA target. SnoRNPs are involved in eukaryal rRNA modifications whereas stand-alone RNA:Y-synthase are involved in tRNA and bacterial rRNA modifications. Three counterparts of the H/ACA snoRNAs had been discovered in Archaea when I started my PhD work, but their contribution to rRNA modification was not demonstrated. We developed a computational approach to identify the H/ACA sRNA genes and their rRNA targets. Its application to the Pyrococcus abyssi genome revealed 7 candidate genes. We verified their expression and experimentally identified 14 Y in the P. abyssi rRNAs. We succeeded in the in vitro reconstitution of active H/ACA sRNPs and thereby studied the sRNP assembly mechanism, identified important H/ACA sRNA structural features and assigned 12 of the identified Y residues to the 7 sRNAs. The application of the computational approach to the other archaeal genomes revealed 90 sRNA genes. This repertoire shed new light on the function and the evolution of this ncRNA class. In addition, we experimentally demonstrated for the first time that a few H/ACA sRNAs are involved in tRNA modification. We also showed that the enzyme of the H/ACA sRNP (aCBF5) is involved in Y55 formation in all archaeal tRNAs without the use of an H/ACA sRNA. We compared the guided and non-guided CBF5 activities and identified aminoacids which are important for these activities.
Source: http://www.theses.fr/2007NAN10110/document